Summary

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

Published: April 02, 2013
doi:

Summary

Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.

Abstract

Vele intracellulaire bacteriële pathogenen gebruiken zoetwater protozoa als natuurlijke reservoir tot proliferatie in het milieu. Legionella pneumophila, de veroorzaker van de veteranenziekte longontsteking, krijgt een pathogeen ten opzichte van in vitro gekweekte bacteriën bij eerste geoogst protozoa cellen voor infectie van zoogdierlijke macrofagen. Dit suggereert dat belangrijke virulentiefactoren niet goed worden uitgedrukt in vitro. We hebben een handelbaar systeem voor priming L. pneumophila door haar natuurlijke protozoaire gastheer Acanthamoebacastellanii voorafgaand aan zoogdiercellen infectie. De bijdrage van elke virulentiefactor kan worden onderzocht door het vergelijken van intracellulaire groei van een mutant stam met wildtype bacteriën na priming protozoa. GFP-expressie wild-type en mutant L. pneumophila stammen worden gebruikt om protozoa monolagen infecteren in een priming stap en men late stadia van intracellulaire groei bereiken. Fluorescerende bacteriën worden geoogst van deze geïnfecteerde cellen en genormaliseerd door spectrofotometrie vergelijkbare aantallen bacteriën voor een volgende infectie in zoogdierlijke macrofagen genereren. Voor de kwantificering worden levende bacteriën gecontroleerd na infectie met fluorescentie microscopie, flowcytometrie en door kolonie plating. Deze techniek belicht en vertrouwt op de bijdrage van gastheercel-afhankelijke genexpressie door het nabootsen van de omgeving die zou worden aangetroffen in een natuurlijke acquisitie route. Deze benadering kan worden gewijzigd om een ​​bacterie die een intermediaire gastheer gebruikt als een middel voor het verkrijgen van een pathogene voordeel bieden.

Introduction

Tal van bacteriële pathogenen hebben zich aangepast algemene strategieën om gastheercellen voor overleving en replicatie in een intracellulair compartiment te exploiteren. In veel gevallen pathogene mechanismen vergelijkbaar protozoaire en metazoïsche cellen. Deze twee micromilieus zeer verschillend en kunnen resulteren in differentiële expressie van virulentiefactoren 1-4. De veteranenziekte bacterie Legionella pneumophila is alomtegenwoordig geassocieerd met zoetwater omgevingen over de hele wereld 5. Belangrijker L. pneumophila gekweekt in protozoa cellen voor infectie van humane monocyten krijgen een pathogene voordeel suggereert dat globale genexpressie profielen van de bacterie verlaat een protozoa cel zijn anders dan die van de in vitro gekweekte organisme 6-8. In de natuur, zoetwater amoeben geven voedselrijk grenzen voor snelle amplificatie van een binnenvallende bacterie. Human overname van L. pneumophila wordt meestal toegeschreven aan inademing van besmet water druppels die de bacterie bevatten. Het is waarschijnlijk dat deze druppeltjes haven protozoa cel-geassocieerde bacteriën, protozoa, waar cellen meer resistent zijn voor conventionele waterbehandeling praktijken 9,10. Infectie van long alveolaire macrofagen verloopt op een wijze die nagenoeg identiek aan de intracellulaire levenscyclus van de bacterie in protozoa gastheercellen 11-13.

Om te overleven en repliceren in eukaryotische cellen, L. pneumophila gebruikt een speciaal type IVb secretiesysteem genoemd Dot / Icm tot bijna 300 'effector' eiwitten te leveren in het cytosol van de gastheercel 14-16. Deze effector eiwitten collectief functioneren om cellulaire processen ondermijnen om een replicatie permissieve compartiment voor de bacterie 17,18 genereren. Deleties in elk van de 26 genen die de Dot / Icm transporter resultaat stammen gebrekkig intracellulaire mult omvatteniplication 19-23. Historisch deletie van afzonderlijke effector coderende genen zelden geleid stammen verzwakt voor intracellulaire groei. Dit fenomeen wordt toegeschreven aan verschillende hypothesen waaronder redundante functie en paraloge kopieën van effectoren.

Sommige virulentiefactoren alleen uitgedrukt in de context van gastheercel-geassocieerde intracellulaire groei 24. We gerationaliseerd dat indien een bepaalde effector werd enkel in de context van protozoaire infectie dan de bijdrage van de effector kan worden vergeleken met een wild-type stam wanneer beide werden gekweekt in vitro. L. pneumophila overgangen van een replicatieve een doorlatende fase komt deze stationaire fase in cultuur 25. De fase-draaing fenotype vertegenwoordigt de tekort aan nutriënten die tijdens intracellulaire groei en wordt geïllustreerd door middel van montage van flagella voor motiliteit 26. Omdat L. pneumophila is meer invasiesieve en virulente wanneer geoogst van protozoaire cellen, zochten we naar een test waarmee meer getrouw de pathogene toestand van de bacterie vertegenwoordigde toen het geconfronteerd gastheer macrofagen ontwikkelen.

Hiervoor hebben we een veelzijdige protozoa priming assay dat geschikte gastheer voor zowel de eerste (priming cel) en tweede (doelcel) fase infecties geschikt. De infectie proces tractable door gebruik van bacteriën die stabiel green fluorescent protein (GFP). De infectie model voor de protozoaire Acanthamoebacastellanii volgt een methode op grote schaal gebruikt op het gebied 27. De aanzuiging stap L. pneumophila stammen worden gekweekt in vitro naar stationaire fase in vloeibare media als 'doorlatende' bacteriën (Figuur 1A) produceren. Bacteriën worden vervolgens gebruikt om monolagen van A. infecteren castellanii gedurende 18 uur op een laat stadium van de intracellulaire levenscyclus te bereiken. Grote vacuolen bevattenbacteriën te kunnen gevisualiseerd op dit tijdstip met fluorescentiemicroscopie (Figuur 1A). Protozoa cellen worden daarna gelyseerd en bacteriën gewonnen uit het lysaat worden gemeten emissie bij 512 nm met een fluorescentie-plaatlezer. Fluorescentie wordt gecorreleerd met optische dichtheid veelvoud-van-infectie (MOI) te berekenen voor de infectie van doelcellen (figuur 1 * Correlatie Curve). Na invasie (T 0) en 18 uur post-invasie (T 18), zijn doelcellen gekwantificeerd voor fluorescentie, wat neerkomt op intracellulaire bacteriën. Fluorescentie kan worden gevolgd door microscopie en flowcytometrie, en levensvatbare tellingen kan worden gemeten door kolonie plating. De priming test wordt altijd begeleid door infecties met wild-type L. pneumophila en een stam defect in de Dot / Icm type IV secretiesysteem (Δ DOTA) (Figuur 1A). Dit biedt vooral interne controles voor directe vergelijkingen tussen wild-type eennd elke mutant isogene stammen die in het infectieproces. De opname van de avirulente stam Δ DOTA tijdens het vullen decors een drempelwaarde voor waarneming van verzwakte groei fenotypen geassocieerd met isogene mutanten die worden gekweekt in vitro.

Protocol

1. Voorbereiding van Legionella pneumophila Cultures for Priming Stage Infecties Transformeer alle L. pneumophila stammen die in de bepaling met het plasmide pAM239, codeert voor een isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induceerbare green fluorescent protein (GFP) 28. Streak de bacteriestammen op ijzer en cysteine ​​aangevuld N-(2-acetamido)-2-aminoethaansulfonzuur (ACES) gebufferde kool gistextractagar (CYEA) met 6,25 pg / ml chlooramfenicol (CM) (vo…

Representative Results

Een typisch resultaat voor het gehele infectie wordt beschreven in figuur 1. Live cell fluorescentie microfoto beeltenis van monolagen van A.castellanii geïnfecteerd met wild-type L. pneumophila tijdens het vullen fase is weergegeven in figuur 1A. Een succesvolle maatregel van de priming stap leidt tot een populatie van ongeveer 90% van de gastheercellen die grote vacuolen gevuld met GFP gemerkte bacteriën bij deze MOI. Op 18 uur na infectie meeste A. castellanii…

Discussion

Bacteriële genexpressie wordt streng gecontroleerd door een combinatie van levenscyclus en de reactie op signalen in de omgeving micromilieu. Vacuolaire ziekteverwekkers zoals L. pneumophila reageren op een groot aantal gastheercel afgeleide signalen bij compartimenten in een fagosoom. Als collectief gevolg van uitputting nutriënten in de gastheercel, de bacterie compenseert expressie factoren vereist voor succesvolle verspreiding naar een volgende gastheercel 25. L. pneumophila aangepast …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken dr. Craig Roy en Dr Dario Zamboni voor het verstrekken van een sjabloon voor protozoaire cel infecties. Wij danken dr. Jagdeep Obhrai, Dr Georgiana Purdy, Dr Fred Heffron en Todd Wisner voor apparatuur en reagentia; Dr Lulu Cambronne voor kritische beoordeling van het manuscript. Flow cytometrie werd uitgevoerd bij de OHSU Flowcytometrie Shared Resource faciliteit. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie ​​van de Medical Research Foundation van Oregon en een NIH subsidie ​​R21 AI088275 (EDC).

Materials

Reagent
chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 antibiotic
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
ACES Sigma A9758-1KG media component
ATCC medium: 712 PYG ATCC growth media for protozoans
1X PBS Fisher Scientific SH30256FS phosphate buffered saline
activated charcoal Fisher Scientific C272-212 media component
yeast extract Fisher Scientific BP1422-500 media component
peptone BD Diagnostics 211677 media component
agar Fisher Scientific BP1423-2 media component
L-cysteine, 99%+ Acros organics 173601000 media supplement
Ferric nitrate nonahydrate Fisher Scientific I110-100 media supplement
Equipment
EVOS fl AMG EVOS fl fluorescence microscope
Smart Spec Plus Bio-Rad 170-2525 spectrophotometer
5810 R centrifuge Eppendorf 22627023 bench top centrifuge
Repeater plus Eppendorf 22230201 repeating pipette
SpectraMax Gemini EM Molecular Devices microplate reader
Softmax Pro 5.3 Molecular Devices 0200-310 microplate reader software
5424 microfuge Eppendorf 22620401 table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II Scienceware 379111010 pipette aid
FACS Calibur BD Bioscience flow cytometer
FlowJo 7.6.1 FlowJo license flow cytometery software
15 ml tube BD Falcon 352096 polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube Neptune 3745.X microcentrifuge tubes

References

  1. Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
  2. Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
  3. Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
  4. Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
  5. Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
  6. Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
  7. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
  8. Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
  9. Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
  10. King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
  11. Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
  12. Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
  13. Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
  14. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
  15. Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 .
  16. Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
  17. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
  18. Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
  19. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
  20. Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
  21. Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
  22. Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
  23. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  24. Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
  25. Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
  26. Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
  27. Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
  28. Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
  29. Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
  30. Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).

Play Video

Cite This Article
Drennan, S. L., Lama, A., Doron, B., Cambronne, E. D. Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria. J. Vis. Exp. (74), e50300, doi:10.3791/50300 (2013).

View Video