Summary

Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti

Published: May 30, 2013
doi:

Summary

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Abstract

CD4 + cellule T regolatorie (Treg) sono potenti modulatori immunitari e servono una funzione importante nella omeostasi immunitaria umana. L'esaurimento delle Tregs ha determinato aumenti misurabili in antigene-specifiche risposte delle cellule T nelle impostazioni del vaccino per il cancro e gli agenti patogeni infettivi. Tuttavia, il loro ruolo in HIV-1 immuno-patogenesi rimane controversa, in quanto potrebbero servire sia per sopprimere deleteria attivazione immunitaria HIV-1-associata e quindi rallentare la progressione della malattia da HIV-1 o in alternativa sopprimere l'immunità HIV-1-specifica e, quindi, promuovere virus diffondersi. La comprensione e la funzione Treg modulando nel contesto di HIV-1 potrebbero portare a potenziali nuove strategie di immunoterapia o vaccini contro l'HIV. Tuttavia, importanti questioni aperte rimangono sul loro ruolo nel contesto di HIV-1, che deve essere studiato con attenzione.

Rappresentando circa il 5% di CD4 + cellule T nel sangue periferico, studiando la popolazione Treg è dimostrato difficile, esspecialmente in HIV-1 individui infetti in cui l'HIV-1-associati delle cellule T CD4 e si verifica che la deplezione Treg. La caratterizzazione delle cellule T regolatorie in individui con HIV in fase avanzata-1 malattia o campioni di tessuto, per cui solo molto piccoli campioni biologici possono essere ottenuti, è quindi estremamente impegnativo. Noi proponiamo una soluzione tecnica per superare queste limitazioni utilizzando l'isolamento e l'espansione delle Treg da individui HIV-1-positivi.

Qui si descrive un metodo semplice e affidabile per espandere con successo Treg isolate da individui HIV-1-infetti in vitro. Flow-sorted CD3 + CD4 + CD25 + CD127 partire Tregs state stimolate con anti-CD3/anti-CD28 perline rivestite e coltivate in presenza di IL-2. L'espanso Treg espresso alti livelli di FOXP3, CTLA4 e HELIOS rispetto alle cellule T convenzionali e risultano essere molto soppressiva. Più facile l'accesso a un gran numero di Treg permetterà ai ricercatori di affrontare importante domande riguardanti il ​​loro ruolo in HIV-1 immunopatogenesi. Crediamo rispondere a queste domande può fornire indicazioni utili per lo sviluppo di un efficace vaccino HIV-1.

Introduction

Con più di 34 milioni di persone che vivono con l'HIV / AIDS in tutto il mondo e si stima che 2,5 milioni di persone recentemente infettate nel 2011, la necessità di un efficace vaccino HIV per frenare l'epidemia di HIV in tutto il mondo rimane fondamentale. Tuttavia, nonostante tre decenni di intensi sforzi di ricerca, gli HIV-1 vaccino prove di efficacia fino ad oggi hanno portato solo una protezione modesta 1-3 ed i correlati di protezione immunitaria sono ancora limitate. Delucidare la natura della risposta immunitaria necessaria per la protezione è essenziale per la progettazione strategica di un efficace vaccino HIV-1 e di altre strategie immunoterapeutiche di targeting HIV-1.

CD4 Naturali + cellule T regolatorie (Treg) sono fondamentali per il mantenimento dell'omeostasi delle cellule immunitarie attraverso il controllo attivazione immunitaria eccessiva, limitando così i danni ai tessuti immuno-mediata. Tuttavia, possono anche sopprimere le risposte immunitarie contro gli agenti patogeni e prevenire la loro liquidazione. Cancro e Hepatitis studi vaccino B hanno dimostrato che diminuendo l'attività di Treg può migliorare la risposta al vaccino e antigene-specifica immunità contro i virus 4-7. Tuttavia, nel contesto di infezione da HIV-1, l'esatto impatto delle cellule T regolatorie rimane completamente compresa. Tregs hanno mostrato di diminuire la replicazione virale in cellule T attivate 8 ed eventualmente urtare attivazione immunitaria 9. Sono stati anche dimostrato di sopprimere le risposte immunitarie HIV-1-specifiche, che potrebbe avere conseguenze negative per la progressione della malattia 10,11. Così, prima di poter modulare l'attività Treg per migliorare l'efficacia di un vaccino di HIV-1, è importante ottenere una visione più la loro funzione in questo contesto malattia.

CD4 + umane cellule T regolatorie sono una popolazione di cellule relativamente scarsa, che rappresentano circa il 5% delle cellule T CD4 + nel sangue periferico, e il loro numero assoluto ulteriore diminuzione con CD4 HIV-associati + T deplezione delle cellule 12 </ Sup>. Saggi attuali per valutare la funzione Treg, come ad esempio T saggi di proliferazione delle cellule Treg con co-coltura, utilizzare il numero di cellule relativamente grandi 12. Pertanto, la funzione e la specificità delle cellule T regolatorie che caratterizza in persone con HIV in stadio avanzato 1 malattia è stato impegnativo, nonostante la loro importanza per la patogenesi dell'HIV.

L'isolamento e l'espansione ex vivo di Treg da HIV-1 i pazienti potrebbero rappresentare una soluzione per superare alcune di queste limitazioni. Qui si descrive un protocollo semplice e robusto per espandere Treg funzionale derivato da HIV-1 individui infettati in vitro, abbiamo ulteriormente spieghiamo come loro fenotipo e testare la loro funzione soppressiva utilizzando saggi di citometria a flusso. Crediamo che questo protocollo faciliterà l'accesso al Treg e di aiuto per capire il loro ruolo in HIV-1 la progressione della malattia.

Protocol

1. Regulatory T cell isolation from HIV-1 Positive Blood Carefully transfer blood, collected in ACD tubes, into a 50 ml conical tube for a final volume of 15 ml blood per tube. Add 25 μl/ml of blood of RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail, mix carefully and incubate 20 min at room temperature. Add 15 ml of PBS/2% FBS to the blood and mix carefully. Layer the diluted blood sample on top of 15 ml of Histopaque at room temperature in a 50 ml conical tube. Spin the conical t…

Representative Results

The expression of interleukin 2 receptor (CD25) and the interleukin 7 receptor (CD127) have been described as reliable surface markers to identify functional Treg populations 13 and have been shown to correlate with CD4+CD25+FOXP3+ Tregs 9,12. Figure 1 represents the gating strategy used to flow-sort single CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs from PBMC isolated from an HIV-1-positive individual. The CD25/CD127 anti…

Discussion

Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) 15, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by research funding from the Elisabeth Glaser Pediatric AIDS Foundation (Pediatric HIV Vaccine Program Award MV-00-9-900-1429-0-00 to MMA), MGH/ECOR (Physician Scientist Development Award to MMA), NIH NIAID (KO8219 AI074405 and AI074405-03S1 to MMA), and the Harvard University Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI060354) which is supported by the following NIH Co-Funding and Participating Institutes and Centers: NIAID, NCI, NICHD, NHLBI, NIDA, NIMH, NIA, FIC, and OAR. These studies were furthermore supported by the Bill & Melinda Gates Foundation and the Terry and Susan Ragon Foundation.

Materials

      Reagents
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail Stemcells technologies 15062  
PBS Sigma D8537  
FBS Sigma F4135  
Histopaque Sigma H8889  
Anti-CD3-PECy7 BD Pharmingen 557851  
Anti-CD4-FITC eBioscience 11-0049-42  
Anti-CD25-APC eBioscience 17-0259-42  
Anti-CD127-PE BD Pharmingen 557938  
Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh BD Falcon 352235  
X-VIVO 15 Lonza 04-418Q  
Penicillin/Streptomycin Mediatech 30-001-Cl  
Human Serum Gemini Bio-Products 100-512  
Human T-activator CD3/CD28 Life Technologies 111.31D  
IL-2 NIH Aids Research & Reference Reagent Program 136  
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Life technologies L34955  
Anti-CD4-qdot-655 Life Technologies Q10007  
Anti-CD25-PECy5 eBiosciences 15-0259-42  
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set eBiosciences 00-5523-00  
Anti-FOXP3-PE eBiosciences 12-4776-42  
Anti-HELIOS-FITC Biolegend 137204  
Anti-CTLA4-APC BD Pharmingen 555855  
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Life Technologies C34557  
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Life Technologies V12883  
HEPES Mediatech 25-060-Cl  
Treg Suppression inspector Miltenyi Biotec 130-092-909  
Anti-CD4-APC BD Pharmingen 340443  
Anti-CD8-AF700 BD Pharmingen 557945  
RPMI 1640 Sigma R0883  
Glutamine Mediatech 25-002-Cl  
      Materials
BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) Becton, Dickinson and Company (BD) 364606  
FACSAria IIu Cell Sorter BD Biosciences  
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences  
FlowJo Tree Star v887  

References

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Cite This Article
Angin, M., King, M., Addo, M. M. New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals. J. Vis. Exp. (75), e50244, doi:10.3791/50244 (2013).

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