Summary

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

Published: May 30, 2013
doi:

Summary

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Abstract

CD4 + regulatorischen T-Zellen (Tregs) sind potente Immunmodulatoren und haben eine wichtige Funktion in der menschlichen Immunhomöostase. Depletion von Tregs hat messbare Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten in Impfstoff Einstellungen für Krebs und infektiösen Erregern führte. Jedoch bleibt ihre Rolle in HIV-1 Immuno-Pathogenese umstritten, da sie entweder könnte dazu dienen, schädliche HIV-1-assoziierten Aktivierung des Immunsystems zu unterdrücken und so langsam HIV-1 Fortschreiten der Krankheit zu unterdrücken oder auch HIV-1-spezifische Immunität zu fördern und dadurch Virus verbreiten. Understanding und modulierende Treg-Funktion im Rahmen der HIV-1 könnte zu möglichen neuen Strategien zur Immuntherapie oder HIV-Impfstoffe führen. Dennoch bleiben wichtige Fragen offen über ihre Rolle im Zusammenhang mit der HIV-1-Infektion, die sorgfältig untersucht werden muss.

Stellvertretend für rund 5% des menschlichen CD4 + T-Zellen im peripheren Blut, das Studium der Treg Population hat sich als schwierig erwiesen, essondere in HIV-1-infizierten Individuen, wo HIV-1-assoziierten CD4 T-Zell-und damit Treg Erschöpfung auftritt. Die Charakterisierung von regulatorischen T-Zellen bei Patienten mit fortgeschrittener HIV-1 Erkrankung oder Gewebeproben, für die nur sehr kleinen biologischen Proben erhalten werden können, ist es äußerst schwierig. Wir schlagen vor, eine technische Lösung für diese Einschränkungen zu überwinden mit Isolierung und Expansion von Tregs von HIV-1-positiven Personen.

Hier beschreiben wir eine einfache und robuste Methode erfolgreich ausbauen Tregs isoliert von HIV-1-Infizierten in vitro. Durchfluss-sortierten CD3 + CD4 + CD25 + CD127 niedrig Tregs wurden mit anti-CD3/anti-CD28 beschichtete Beads stimuliert und kultiviert in Gegenwart von IL-2. Die erweiterte Tregs exprimiert hohe FOXP3, CTLA4 und HELIOS im Vergleich zu herkömmlichen T-Zellen und erwiesen sich als sehr suppressive. Leichterer Zugang zu einer großen Anzahl von Tregs erlaubt Forschern, i Adressemportant Fragen über ihre Rolle im HIV-1 Immunpathogenese. Wir glauben, dass die Beantwortung dieser Fragen können nützliche Erkenntnisse für die Entwicklung eines wirksamen HIV-1-Impfstoff bereitzustellen.

Introduction

Mit mehr als 34 Millionen Menschen mit HIV / AIDS weltweit schätzungsweise 2,5 Millionen Menschen im Jahr 2011 neu infiziert, die Notwendigkeit einer wirksamen HIV-Impfstoff, um die weltweite HIV-Epidemie einzudämmen bleibt von größter Bedeutung. Doch trotz drei Jahrzehnten intensiver Forschung haben sich die HIV-1-Vakzine Wirksamkeitsstudien bisher nur bescheidenen Schutz 1-3 führte und die Korrelate der schützenden Immunität bleiben weitgehend unverstanden. Erläuterung der Art der Immunantwort zum Schutz benötigt ist für die strategische Gestaltung einer wirksamen HIV-1-Impfstoff und anderen immuntherapeutischen Strategien gegen HIV-1-Infektion.

Natürliche CD4 + regulatorische T-Zellen (Tregs) sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase Immunzellen durch Steuern übermäßige Aktivierung des Immunsystems und begrenzt somit immun-vermittelte Gewebeschädigung. Sie können aber auch zu unterdrücken Immunantworten gegen Pathogene und verhindern deren Beseitigung. Krebs und Hepatitis B Impfstoff-Studien haben gezeigt, dass die Verringerung der Aktivität von Tregs kann Impfstoff Reaktion und Antigen-spezifische Immunität gegen Viren 4-7 zu verbessern. In Zusammenhang mit der HIV-1-Infektion, ist die genaue Auswirkung von regulatorischen T-Zellen nicht vollständig verstanden. Tregs wurde gezeigt, dass die Virusreplikation in aktivierten T-Zellen 8 zu verringern und möglicherweise Auswirkungen auf Aktivierung des Immunsystems 9. Sie wurden auch gezeigt, dass HIV-1-spezifische Immunantworten, die negative Folgen für die Progression der Erkrankung haben könnten 10,11 unterdrücken. Somit bevor sie zu modulieren Treg Aktivität, um die Wirksamkeit eines HIV-1-Vakzine zu verbessern, ist es wichtig, weitere Einblicke in die Funktion gewinnen in diesem Zusammenhang Krankheit.

Menschliche CD4 + regulatorische T-Zellen sind eine relativ knapp Zellpopulation, die etwa 5% der CD4 + T-Zellen im peripheren Blut und ihrer absoluten Zahlen weitere Abnahme mit HIV-assoziierten CD4 + T-Zell-Depletion 12 </ Sup>. Diese Assays Treg Funktion, wie T-Zell-Proliferations-Assays mit Treg Co-Kultur zu beurteilen, mit relativ großer Zellzahlen 12. Daher kennzeichnenden Funktion und Spezifität von regulatorischen T-Zellen bei Patienten mit fortgeschrittener HIV-1-Erkrankung ist schwierig gewesen, trotz ihrer Bedeutung für die HIV-Pathogenese.

Die ex vivo Isolation und Expansion von Tregs von HIV-1-Patienten könnte eine Lösung für einige dieser Einschränkungen zu überwinden. Hier beschreiben wir eine einfache und robuste Protokoll zu funktionellen Tregs von HIV-1-infizierten Individuen in vitro abgeleitet erweitern; wir weiter, wie man ihnen zu erklären, Phänotyp und testen ihre suppressive Funktion mit durchflusszytometrischen Assays. Wir glauben, dass dieses Protokoll wird der Zugang zu Tregs erleichtern und das Verständnis ihrer Rolle in HIV-1 Fortschreiten der Erkrankung.

Protocol

1. Regulatory T cell isolation from HIV-1 Positive Blood Carefully transfer blood, collected in ACD tubes, into a 50 ml conical tube for a final volume of 15 ml blood per tube. Add 25 μl/ml of blood of RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail, mix carefully and incubate 20 min at room temperature. Add 15 ml of PBS/2% FBS to the blood and mix carefully. Layer the diluted blood sample on top of 15 ml of Histopaque at room temperature in a 50 ml conical tube. Spin the conical t…

Representative Results

The expression of interleukin 2 receptor (CD25) and the interleukin 7 receptor (CD127) have been described as reliable surface markers to identify functional Treg populations 13 and have been shown to correlate with CD4+CD25+FOXP3+ Tregs 9,12. Figure 1 represents the gating strategy used to flow-sort single CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs from PBMC isolated from an HIV-1-positive individual. The CD25/CD127 anti…

Discussion

Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) 15, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by research funding from the Elisabeth Glaser Pediatric AIDS Foundation (Pediatric HIV Vaccine Program Award MV-00-9-900-1429-0-00 to MMA), MGH/ECOR (Physician Scientist Development Award to MMA), NIH NIAID (KO8219 AI074405 and AI074405-03S1 to MMA), and the Harvard University Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI060354) which is supported by the following NIH Co-Funding and Participating Institutes and Centers: NIAID, NCI, NICHD, NHLBI, NIDA, NIMH, NIA, FIC, and OAR. These studies were furthermore supported by the Bill & Melinda Gates Foundation and the Terry and Susan Ragon Foundation.

Materials

      Reagents
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail Stemcells technologies 15062  
PBS Sigma D8537  
FBS Sigma F4135  
Histopaque Sigma H8889  
Anti-CD3-PECy7 BD Pharmingen 557851  
Anti-CD4-FITC eBioscience 11-0049-42  
Anti-CD25-APC eBioscience 17-0259-42  
Anti-CD127-PE BD Pharmingen 557938  
Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh BD Falcon 352235  
X-VIVO 15 Lonza 04-418Q  
Penicillin/Streptomycin Mediatech 30-001-Cl  
Human Serum Gemini Bio-Products 100-512  
Human T-activator CD3/CD28 Life Technologies 111.31D  
IL-2 NIH Aids Research & Reference Reagent Program 136  
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Life technologies L34955  
Anti-CD4-qdot-655 Life Technologies Q10007  
Anti-CD25-PECy5 eBiosciences 15-0259-42  
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set eBiosciences 00-5523-00  
Anti-FOXP3-PE eBiosciences 12-4776-42  
Anti-HELIOS-FITC Biolegend 137204  
Anti-CTLA4-APC BD Pharmingen 555855  
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Life Technologies C34557  
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Life Technologies V12883  
HEPES Mediatech 25-060-Cl  
Treg Suppression inspector Miltenyi Biotec 130-092-909  
Anti-CD4-APC BD Pharmingen 340443  
Anti-CD8-AF700 BD Pharmingen 557945  
RPMI 1640 Sigma R0883  
Glutamine Mediatech 25-002-Cl  
      Materials
BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) Becton, Dickinson and Company (BD) 364606  
FACSAria IIu Cell Sorter BD Biosciences  
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences  
FlowJo Tree Star v887  

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Cite This Article
Angin, M., King, M., Addo, M. M. New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals. J. Vis. Exp. (75), e50244, doi:10.3791/50244 (2013).

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