Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen
Summary
Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.
Abstract
Zaman aralıklı görüntüleme meme kanseri farklı genetik olarak fare modelleri elde edilen kültür birincil preneoplastic meme epitelyal hücrelerinin davranışını karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, hücre bölünmeleri (hücre yaşam), apoptotik hücre sayıları, morfolojik değişiklikler evrimi ve koloni oluşum mekanizması arasındaki zaman ölçülebilir ve belirli genetik lezyonlar taşıyan hücreler karşılaştırıldı. Primer meme epitel hücre kültürlerinde palpabl tümör olmadan meme bezleri tarafından üretilir. Bezler dikkatlice bitişik kas açık bir ayrım ile eksize edilir, lenf düğümleri kaldırılır ve zenginleştirilmiş meme epitelyal hücrelerinin tek hücre süspansiyonları enzimatik çözünme ve süzme, ardından kıyma meme dokusu tarafından oluşturulur. Tek hücre süspansiyonları canlı hücre görüntüleme için bir inkübatör içinde kaplama ve mikroskop altında doğrudan yerleştirilir. Her w bir 4×4 konfigürasyonunda Onaltı 650 mikron x 700 mikron alanları6-kuyulu plakanın arşın 5 gün için her 15 dakikada görüntülü. Time-lapse görüntüleri doğrudan ilk 24 hücreleri kaplama ve sa (agregasyon karşı hücre çoğalması), apoptoz insidansı ve morfolojik değişikliklerin aşamalı içinde hücre koloni oluşum mekanizması ve frekans içerebilir hücresel davranışları ölçmek için incelenmiştir. Tek hücreli izleme bireysel hücre yaşam ve hücre bölünmesi desen soruşturma ölçümü için hücre kaderinin haritaları oluşturmak için kullanılır. Nicel veriler istatistiksel olarak belirli genetik lezyonlar ile ilişkili davranış önemli farklılıklar için değerlendirmek için analiz edilir.
Introduction
Genetik mühendisliği fare modelleri incelemek ve farklı genetik lezyonlar meme kanseri riskine katkıda anlamak için kullanılan araçlardır. Örneğin, genetiğiyle oynanmış farelerin göstermiştir ki, üç faktörün kombinasyonu: tam uzunlukta meme kanseri 1, erken başlangıçlı (BRCA1) meme epitel hücrelerinde gen, tümör protein p53 (TP53) germ-line haploinsufficiency ve epitel meme kaybı hücre hedefli up-regüle östrojen reseptör alfa, BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse Meme Tümör Virüsü (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator (% 100 oranında meme kanseri gelişiminde (ERA) ifadesi sonuçları tet-op) -ER/MMTV-reverse tetrasiklin Transaktivatörü (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 bildirilen düşük yüzdeler + / karşılaştırıldığında yaş 12 ay rtTA farelerde – ERA olmadan fareler aşırı ekspresyonu (~ 50 – % 60) ve TP53 haploinsuf olmadan BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre farelerdeficiency (<% 5). 1
Preneoplastic birincil meme epitel hücrelerinin davranış Dinamik time-lapse görüntüleme az kolayca statik doku kesitlerinde takdir hücre davranış farklılıkları ortaya koymaktadır. Proliferasyon ve farklılaşma değişiklikler insan BRCA1 mutasyon taşıyıcılarında primer meme hücrelerinde görülmektedir. Tek hücre normalden birincil meme epitel hücrelerinin süspansiyonlar ve genetiğiyle oynanmış farelerin 2 Yaratılış Rezeke meme bezi dokusu enzimatik ayrışma yoluyla üretilir. 3. Time-lapse görüntüleri hücre kolonisi görünümü ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve apoptoz gibi hücrelerinde morfolojik değişikliklerin insidansı mekanizmasını ve zamanlamasını değerlendirmek için görüntülenebilir. Hücre kaderinin harita üretimi, hücre bölünmeleri (hücre yaşam) ve hücre bölünmesi kalıplarının belirlenmesi arasındaki sürenin uzunluğu ölçümü tek hücreli izleme kullanımı ile kolaylaştırılmaktadır. Timm'S Takip Aracı (TTT) tek hücre kaderinin haritaları oluşturmak için kullanılan kamuya açık yazılım. Hücre kaderinin mekanizmalarının aydınlatılmasına Onun programı normal hematopoetik kök hücre gelişimi 6-9 ve nöronların nesil inceleyerek 4,5 kurulmuştur. 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritik adımlar
Bu meme bezlerinin meme epitel hücre davranışlarını yaşa bağlı değişkenlik kontrol etmek için aynı yaştaki farelerin hasat sağlamak için önemlidir. Hücreler kaplama, hücreler aynı sayıda her bir deney için her bir kuyuya kaplanacaktır. Kültürler mümkün seri görüntüleri aracılığıyla birden çok tek tek hücrelerin takip yapma çok hızlı konfluent olmazlar böylece kaplama yaparken Hücreleri nispeten seyrek olmalıdır. Bu plaka dengelenmiş son…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar canlı hücre görüntüleme yaptığı giriş için teknik yardım ve Michael Rieger için Bofan Wu ve Hıristiyan Raithel teşekkür etmek istiyorum. NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH tarafından desteklenir. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Savunma Bakanlığı W81XWH-11-1-0074 (REN), Eğitim, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (R31-10069) tarafından finanse Kore Ulusal Araştırma Vakfı aracılığıyla WCU (World Class Üniversitesi) programı (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Kemirgen Bariyer Tesisi Ekipman) ve NIH NCI 5P30CA051008 (Mikroskopi ve Görüntüleme ve Hayvansal Paylaşılan Kaynakları).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
- Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).
- Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453, 345-351 (2008).
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
