Se presenta un método para aislar precursoras derivadas de la piel (SKP) células multipotentes ingenuos de cultivos de fibroblastos humanos primarios. Se demuestra que estos SKPs derivados de cultivos de fibroblastos comparten propiedades de células madre similares a los obtenidos directamente a partir de biopsias de piel humana. Estas células expresan el marcador de la cresta neural, nestina, además de los marcadores multipotentes, tales como Oct4 y Nanog.
Durante la última década, varias poblaciones de células madre adultas se han identificado en la piel humana 1-4. El aislamiento de los precursores multipotenciales dérmicos adultos se informó por primera vez por Miller F. D de laboratorio 5, 6. Estos primeros estudios describen una población de células precursoras multipotentes a partir de la dermis de mamífero adulto 5. Estas células – SKPs denominados precursores, para derivadas de la piel – se aislaron y expandieron a partir de roedores y de la piel humana y se diferencian tanto en la progenie neuronal y mesodérmico, incluyendo tipos de células nunca se encuentran en la piel, tales como las neuronas 5. Estudios inmunocitoquímicos en SKPs cultivadas revelaron que las células expresan vimentina y nestina, una proteína de filamento intermedio expresado en precursores neuronales y musculares del esqueleto, además de fibronectina y marcadores de células madre multipotentes 6. Hasta ahora, las células madre adultas SKPs población han sido aislados de recién recogidas biopsias de piel de mamífero.
ve_content "> Recientemente, hemos establecido e informó que una población de células precursoras derivadas piel puede permanecer presente en cultivos de fibroblastos primarios establecidos a partir de biopsias de la piel 7. La suposición de que algunas células madre somáticas pueden residir en cultivos de fibroblastos primarios en duplicaciones de la población primitiva era basan en las siguientes observaciones: (1) SKPs y cultivos de fibroblastos primarios se derivan de la dermis, y por lo tanto, un pequeño número de células SKP podrían permanecer presente en cultivos de fibroblastos dérmicos primarios y (2) los cultivos primarios de fibroblastos cultivados a partir de alícuotas congelados que han sido sometidos a temperatura desfavorable durante el almacenamiento o transferencia contenía un pequeño número de células que permanecieron viables 7. Estas células raras fueron capaces de ampliar y se pudo pasar varias veces. Esta observación sugiere que un pequeño número de células con alta potencia de proliferación y la resistencia al estrés estuvieron presentes en cultivos de fibroblastos humanos 7.Nos aprovechamos de estos resultados para establecer un protocolo para el aislamiento rápido de las células madre adultas a partir de cultivos primarios de fibroblastos que son fácilmente disponibles en los bancos de tejidos de todo el mundo (Figura 1). Este método tiene un significado importante, ya que permite el aislamiento de las células precursoras cuando las muestras de piel no son accesibles mientras que cultivos de fibroblastos pueden estar disponibles en los bancos de tejidos, por lo tanto, la apertura de nuevas oportunidades para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a enfermedades genéticas raras, así como enfermedades de modelado en un plato.
Utilizando el método descrito en este documento, las células madre dérmicas ingenuos se pueden aislar a partir de cultivos primarios de fibroblastos dérmicos. Con este enfoque, se informó recientemente, el aislamiento y caracterización de células madre adultas de cultivos de fibroblastos procedentes de pacientes con un síndrome genético raro, Hutchinson-Gilford progeria síndrome 7. Como se muestran en este documento esos precursores células expresan marcadores de células madre son capaces de auto-…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alexander von Humboldt (5090371), el Centro de Kühne Christine para alérgicos Investigación y Educación (CK-CARE), y el Bayerischen Staatsministerium (para KD).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
Methanol | Roth | 8388.2 | |
Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
Table 2. Specific reagents and equipment. |