Здесь мы опишем технику оптимизированный для производства высококачественных витаминов A / RBP комплекс и два мониторинга в реальном времени методы для изучения витамина транспорта STRA6, RBP рецепторов.
Витамин А необходим для зрения и роста / дифференциации практически всех органов человека. Плазменные ретинол-связывающего белка (РСБ) является принципом и конкретным носителем витамина А в крови. Здесь мы опишем технику оптимизированный для производства и очистки голо-RBP и два в реальном времени методы мониторинга для изучения транспорта витамина А на высокое сродство рецептора RBP STRA6. Первый метод позволяет производить большое количество высококачественного голо-RBP (100% загружены с ретинолом) витамина транспорта анализов. Высокое качество RBP имеет важное значение для функционального анализа, потому что неправильно свернутых RBP-релизы витамин А легко и бактериального загрязнения в подготовке RBP может привести к появлению артефактов. Мониторинг в реальном времени методы, как электрофизиологии внесли решающий вклад в исследования мембранного транспорта. RBP рецептор-опосредованного транспорта ретинола не были проанализированы в реальном времени до недавнего времени. Второй метод, описанный здесь, является причинамл-временной анализ STRA6 катализируемой ретинол освобождение или нагрузки. Третий способ в режиме реального времени анализ STRA6 катализируемой ретинол транспорта от голо-RBP к сотовым ретинол связывающий белок I (CRBP-I). Эти технологии обеспечивают высокую чувствительность и разрешение при выявлении витамина RBP рецептора механизм усвоения.
Витамин А является органической молекулой, которая необходима для выживания человека и надлежащее функционирование практически всех органов человека. Производные витамина А (ретиноиды) участвовать в разнообразных биохимических и клеточных событий, в том числе датчиков света за 1,2 видение и регуляции экспрессии генов и белков перевода во время эмбрионального развития и в тканях взрослого 3-6. Несмотря на то, ретинол обладает способностью диффундировать системно, эволюция придумала плазмы ретинол связывающий белок, специфический белок-носитель витамина транспорта в крови для достижения высокой эффективности и специфичности и, чтобы избежать токсичности, связанной со случайным диффузии 7-10. Высокое сродство рецептора, который связывается с ОДП и занимает витамин Была выдвинута гипотеза, в 1970-х годах 11-13. Несмотря на фактических данных, накопленных в течение трех десятилетий о существовании рецепторов RBP 14-31, рецептор гипотеза обсуждалась в течение многих лет из-за existencе неправильное определение голо-РСБ. Правильное определение голо-РСБ является то, что высокое сродство комплекса 1:1 между ретинолом и ОДП. Повторное извлечение голо-RBP органических растворителей необходимо производить апо-РСБ. Это определение используется почти во всех лабораториях изучения RBP 7,9,32-35 или рецептора RBP 14-31,36-42. Неверное определение голо-РСБ, который был использован, чтобы опровергнуть существование рецепторов КПБ является острая смесь свободного ретинола с апо-РСБ. Поскольку функция RBP рецептора витамина поглощения от голо-РСБ является освобождение ретинола от голо-РСБ, рецептор RBP будет играть никакой роли в ретинол поглощения, если ретинол является бесплатным для начала (как это было предложено неправильное определение голо -RBP).
Последнее определение RBP рецептора белка домена multitransmembrane называется STRA636 и его функции витамина поглощения от голо-RBP 36-43 решительно выступает против гипотезы, что RBP ненужно рецепторов для доставки витамина А. Подробный анализ показал, что STRA6 имеет 9 трансмембранных доменов с N-конца расположены внеклеточно и С-концом расположена внутриклеточно 40. Расположенный между трансмембранными 6 и 7 является одним из важнейших RBP связывающий домен 39. STRA6 соединен с обеих LRAT и CRBP-I в витамин А поглощение от голо-РСБ, но ни LRAT ни CRBP-я абсолютно необходима для повышения STRA6 деятельности 41. Способность STRA6 по активизации ретинол освобождение от голо-РСБ является ключом к ее поглощению витаминов деятельности 41. Опираясь на STRA6 выпустить свой ретинол, витамины доставки RBP может транспортировать витамин А к клеткам-мишеням в периферических тканях с высокой специфичностью и эффективностью.
Решающее значение голо-RBP определению и подготовке иллюстрируется не только исторические дебаты о существовании рецепторов КПБ, но и трех связанных с недавних работ на основе голо-RBP определения различотличный от оригинала и правильное определение 44-46. В первом документе использованы голо-RBP определение, которое было использовано для одобряют существование RBP рецепторов для изучения рецепторов RBP 44. Вторая и третья работы придумали третье определение голо-РСБ, что сделало его еще менее вероятно, для ретинола должны быть изучены, чтобы сформировать правильный комплекс с ОДП 45,46. Эти исследования подготовлены 3 H-retinol/RBP путем смешивания голо-RBP (даже не апо-РСБ) с 3 H-ретинол. С этого анализа не есть 3 H-retinol/RBP сформирован и не снять излишнее бесплатно 3 H-ретинол 45,46, это не тест для 3 H-ретинол поглощения от 3 H-retinol/RBP, но это бесплатный 3 H-ретинол диффузии анализа. Было показано ранее, что STRA6 не увеличивает поглощение клетками свободного ретинола по LRAT 38 или CRBP-I 41. Практически все ретинола связана с ОДП в крови, и нет обнаруживаемых частотыэлектронной ретинола. Основной функцией рецептора RBP является ускорение ретинол освобождение от голо-РСБ во время ретинол поглощения от голо-RBP 41. Если ретинол искусственно выпустили или в свободной форме, чтобы начать с 45,46, рецептор RBP не нужен. Резко отличается от результатов, полученных свободной анализа диффузии ретинола по сравнению с анализы, основанные на правильно подготовленную голо-RBP показывают, что правильная подготовка RBP имеет решающее значение для его функционального анализа.
RBP может быть очищен из сыворотки крови человека 41, но процедура является сложной и низкая урожайность. Альтернативным подходом является создание RBP в E. палочки. Потому E. палочки не имеют возможности правильно сложить млекопитающих секретируемых белков с более чем одной парой дисульфидных связей, как RBP, важно, чтобы сложите RBP и очистить правильно сложить белка. Неправильно упакованных белков не только ведут себя иначе, исправлены сложенном RBP в различные анализы,но и привести к агрегации белков при хранении. По той же причине, апо-RBP производится только из высококачественных голо-РСБ. Мы описываем здесь оптимизированный протокол для получения высокого качества RBP загружены на 100% с ретинолом через бактериальные выражения, рефолдинг, и ВЭЖХ очистки. ВЭЖХ очистки не только удаляет неправильно сложил ОДП, но и значительное бактериальное загрязнение, которое может вызвать серьезные артефакты, если RBP используются в анализах сигнала. Мы также описывают два чувствительных мониторинга в реальном времени методы для изучения ретинол транспорта STRA6. Оба метода зависит от высокого качества RBP. Из-за ограниченности пространства, классические методы радиоактивного ретиноидов основе и ВЭЖХ на основе витамина А поглощение анализы не были описаны здесь.
Мы разделяем здесь оптимизированный протокол производство ОДП, потому что RBP производства и очистки имеют решающее значение для создания правильно сложить ОДП. Учитывая возможность неправильно свернутых видов ОДП и наличие следовых количеств бактериальных белков даже в ВЭЖХ очищенн…
The authors have nothing to disclose.
Поддержка Национального института здоровья грант R01EY018144.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
guanidine hydrochloride | EMD | 5010 | |
cystine | Sigma | C8755 | |
cysteine | Sigma | C7352 | |
EDTA | Fisher | BP118-500 | |
Tris | Fisher | 7786-1 | |
DTT | EMD | 3860 | |
retinol | Sigma | R7632 | |
carbenicillin | Fisher | BP2648-5 | |
IPTG | EMD | 5810 | |
PBS | EMD | 6508 | |
NaCl | Fisher | BP358-10 | |
Ni-NTA | Qiagen | 1018244 | |
imidazole | EMD | 5720 | |
heptane | EMD | HX0295-1 | |
Blocker Casein | Pierce | 37528 | |
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) | Millipore | UFC901024 | |
Microfluor-2 plate | Fisher | 14-245-177 | |
Hamilton syringe Gastight #1710 | Fisher | 14-824-655 |