כאן אנו מתארים טכניקה אופטימלית לייצור ויטמין איכותי מורכב / RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד ויטמין הובלה בSTRA6, קולט RBP.
ויטמין A חיונית לראייה וגדילה / התמיינות של כמעט כל איברי האדם. החלבון מחייב רטינול פלזמה (RBP) הוא עקרוני ומוביל ספציפי של ויטמין בדם. כאן אנו מתארים טכניקת אופטימיזציה לייצר ולטהר הולוגרמות RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד את ההובלה של ויטמין על ידי הקולטן גבוהה זיקת RBP STRA6. הטכניקה הראשונה מאפשרת לייצר כמות גדולה באיכות גבוהה הולוגרמות RBP (100% טיעון עם רטינול) לויטמין A מבחני תחבורה. RBP איכות הגבוהה הוא חיוני למבחנים תפקודיים בגלל misfolded RBP משחרר ויטמין זיהום חיידקים בקלות והכנת RBP יכול לגרום לחפצים. טכניקות ניטור בזמן אמת כמו electrophysiology תרמו תרומה מכרעת למחקרים של תחבורת קרום. תחבורת רטינול הקולטן בתיווך RBP לא נתח בזמן אמת עד לאחרונה. הטכניקה השנייה שתוארה כאן היא פליליתניתוח L-עת שחרור STRA6-קטליזאטור רטינול או הטעינה. השיטה השלישית היא ניתוח בזמן אמת של STRA6-קטליזאטור תחבורת רטינול מהולוגרמות RBP לסלולרי רטינול חלבון אני מחייב (CRBP-I). טכניקות אלה מספקות רגישות ורזולוציה גבוהה בחשיפת מנגנון ספיגת הוויטמין של הקולטן RBP.
ויטמין A היא מולקולה אורגנית שהיא חיוני להישרדות אנושית ותפקוד התקין של כמעט כל איברי האדם. ויטמין נגזר (רטינואידים) להשתתף באירועים ביוכימיים וסלולריים מגוונים כולל את החישה של אור ל1,2 חזון והרגולציה של ביטוי גנים ותרגום חלבונים במהלך התפתחות עוברית וברקמות בוגרות 3-6. למרות רטינול יש את היכולת לפזר מערכתי, האבולוציה באה עם חלבון פלזמת רטינול מחייב, חלבון נישא ספציפי לויטמין תחבורה בדם כדי להשיג יעילות וסגולית גבוהה ולהימנע מרעילויות קשורות דיפוזיה 7-10 אקראית. קולטן זיקה גבוהה שנקשר לRBP ולוקח ויטמין היה שיערות ב1970 11-13. למרות ראיות שהצטברו בשלושה עשורים על קיומו של הקולטן RBP 14-31, השערת הקולט נדונה במשך שנים רבות בשל existencדואר של הגדרה לא נכונה של הולוגרמות RBP. ההגדרה הנכונה של הולוגרמות RBP היא שזה מורכב 01:01 זיקה הגבוהה בין רטינול וRBP. שאיבה חוזרת של הולוגרמות RBP ידי ממס אורגני היא הכרחית כדי לייצר apo-RBP. הגדרה זו משמשת כמעט על ידי כל המעבדות הלומדות RBP 7,9,32-35 או קולט RBP 14-31,36-42. ההגדרה לא הנכונה של הולוגרמות RBP ששמשה להפריך את קיומו של הקולטן RBP היא התערובת החריפה של רטינול החופשי עם apo-RBP. מאז הפונקציה של הקולטן RBP בויטמין ספיגה מהולוגרמות RBP היא לשחרר רטינול מהולוגרמות RBP, קולט RBP היה לשחק שום תפקיד בספיגת רטינול אם רטינול הוא חופשי להתחיל עם (כפי שהוצע על ידי ההגדרה הנכונה של הולו RBP-).
זיהוי האחרון של הקולטן RBP כחלבון תחום multitransmembrane נקרא STRA636 ותפקודו בספיגת הוויטמין מהולוגרמות RBP 36-43 חזקה טוען נגד ההשערה כי RBP לאצריך קולט לספק ניתוחים מדוקדקים ויטמין A. נמצאו כי STRA6 יש 9 תחומים הטרנסממברני עם N-הסופי ממוקמים extracellularly וC-Terminus ממוקמים intracellularly 40. ממוקם בין הטרנסממברני 6 ו 7 הוא תחום מחייב חיוני RBP 39. STRA6 מצמיד הן LRAT וCRBP-אני בויטמין ספיגה מהולוגרמות RBP, אך גם לא LRAT CRBP-אני דרוש לחלוטין לSTRA6 פעילות מוגברת 41. היכולת של STRA6 לזרז שחרור רטינול מהולוגרמות RBP היא המפתח לויטמינה פעילות ספיגה 41. על ידי הסתמכות על STRA6 לשחרר רטינול, ויטמין מסירה בRBP יכול להסיע ויטמין למקד את התאים ברקמות פריפריה עם סגוליות גבוהות ויעילות.
החשיבות הקריטית של הגדרת הולוגרמות RBP והכנה מודגמת לא רק הדיון ההסטורי על קיומו של הקולטן RBP, אלא גם על ידי שלושה עיתונים האחרונים הבוסס על הולוגרמות RBP אונטערשייד הגדרותשונה שמפה מהגדרה המקורית ונכונה 44-46. העיתון הראשון השתמש בהגדרת הולוגרמות RBP ששמשה לפסול את קיומו של הקולטן RBP ללמוד RBP קולט 44. את המסמכים השניים ושלישיים באו עם הגדרה שלישית של הולוגרמות RBP שעשתה את זה אפילו פחות סביר לרטינול להיחקר כדי ליצור מורכבות נכונות עם RBP 45,46. מחקרים אלה הוכנו על ידי ערבוב 3 H-retinol/RBP הולוגרמות RBP (אפילו לא apo-RBP) עם 3 H-רטינול. מאז assay זה לא היה לי 3 H-retinol/RBP נוצר ולא להסיר המוגזם חופשי 3 H-רטינול 45,46, זה לא assay לספיגת H-3 מ 3 H-retinol/RBP רטינול, אבל הוא חופשי 3 assay דיפוזיה H-רטינול. זה כבר הראה בעבר כי STRA6 לא לשפר את ספיגת הסלולר של רטינול בחינם על ידי LRAT 38 או CRBP-41. כמעט כל רטינול חייב RBP בדם ואין להבחין freהדואר רטינול. פונקציה עיקרית של הקולטן RBP היא לזרז שחרור רטינול מהולוגרמות RBP במהלך ספיגת רטינול מהולוגרמות RBP 41. אם רטינול הוא שוחרר באופן מלאכותי, או בצורה החופשית להתחיל עם 45,46, קולט RBP אין צורך. התוצאות השונות באופן דרמטי המתקבלות מבדיקת דיפוזיה רטינול החופשית בהשוואה למבחנים הבוסס על הוכן כראוי הולוגרמות RBP להמחיש כי הכנה הנכונה של RBP הן קריטיות עבור המבחנים הפונקציונליים שלו.
RBP יכול להיות מטוהר מסרום האדם 41, אך ההליך מורכב והתשואה היא נמוכה. גישה חלופית היא לייצר RBP בE. coli. בגלל E. coli אין יכולת כראוי לקפל חלבונים מופרשים יונקים עם יותר מזוג אחד של אג"ח דיסולפיד כמו RBP, זה חיוני כדי לקפל RBP ולטהר את החלבון המקופל בצורה נכונה. חלבוני Misfolded לא מתנהגים בצורה שונה מרק RBP המקופל תוקן במבחנים שונים,אבל גם לגרום להצטברות חלבון במהלך האחסון. מאותה הסיבה, apo-RBP מיוצר רק מהאיכות גבוהה הולוגרמות RBP. אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימלי לייצר RBP איכות גבוהה 100% עמוסים רטינול דרך ביטוי חיידקים, מקפל, וטיהור HPLC. טיהור HPLC מסירה RBP מקופל באופן שגוי, אלא גם זיהום חיידקים משמעותי שיכול לגרום לממצאים חמורים אם RBP משמש במבחני העברת אותות לא רק. גם אנו מתארים שתי טכניקות בזמן אמת ניטור רגישים ללמוד תחבורת רטינול ידי STRA6. שני הטכניקות תלויות בRBP באיכות גבוהה. בשל מגבלות מקום, בטכניקות הקלסיות של ויטמין retinoid מבוסס וHPLC מבוסס רדיואקטיבי A מבחני ספיגה אינן מתוארות כאן.
אנו חולקים כאן פרוטוקול ייצור RBP אופטימלי בגלל תהליכי ייצור וטיהור RBP הם קריטיים ליצירת RBP מקופל בצורה נכונה. בהתחשב באפשרות של מיני RBP misfolded והנוכחות של כמויות זעירות של חלבונים חיידקיים אפילו בHPLC המטוהר חיידקים מיוצרים RBP, כדאי להשתמש RBP יליד מסרום כדי לאשר מסקנה הקשו…
The authors have nothing to disclose.
נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות המענק R01EY018144.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
guanidine hydrochloride | EMD | 5010 | |
cystine | Sigma | C8755 | |
cysteine | Sigma | C7352 | |
EDTA | Fisher | BP118-500 | |
Tris | Fisher | 7786-1 | |
DTT | EMD | 3860 | |
retinol | Sigma | R7632 | |
carbenicillin | Fisher | BP2648-5 | |
IPTG | EMD | 5810 | |
PBS | EMD | 6508 | |
NaCl | Fisher | BP358-10 | |
Ni-NTA | Qiagen | 1018244 | |
imidazole | EMD | 5720 | |
heptane | EMD | HX0295-1 | |
Blocker Casein | Pierce | 37528 | |
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) | Millipore | UFC901024 | |
Microfluor-2 plate | Fisher | 14-245-177 | |
Hamilton syringe Gastight #1710 | Fisher | 14-824-655 |