Biomacromolecular Uyuşturucu Sitozolik Teslimat için pH-duyarlı endosomolitik Ajanlar değerlendirilmesi için Ex Vivo Kırmızı Kan Hücresi Hemoliz Testi
Summary
Bir hemoliz tahlil hücre içi kargo için ilaç dağıtım sistemleri 'cytocompatibility ve endosomolitik aktivite hızlı, yüksek hacimli ekran olarak kullanılabilir. Tahlil çevresel pH bir fonksiyonu olarak eritrosit membran parçalama ölçer.
Abstract
Endo-lizozomal veziküller oluşturan çift katmanlı fosfolipidlerin hücre içi hedeflere biyolojik ilaçların teslim için bir engel teşkil edebilir. Bu engeli aşmak için, sentetik ilaç taşıyıcı bir dizi aktif endozomal zarı bozar ve sitoplazma içine kargo sunmak için tasarlanmış edilmiştir. Burada, hücre içi ilaç dağıtım sistemleri cytocompatibility ve endosomolitik etkinlik için hızlı, yüksek hacimli ekran olarak kullanılabilir hemoliz tahlil, açıklar.
Hemoliz testi, insan kırmızı kan hücreleri ve test materyalleri ekstraselüler, erken endozomal ve geç endo-lizozomal ortamlarda taklit tanımlanan pH'da tampon co-inkübe edilir. Pelet bozulmamış kırmızı kan hücreleri santrifüj basamağı sonrasında, orta salınan hemoglobin miktarı, spektrofotometrik (en iyi dinamik aralığı için 405 nm) olarak ölçülür. Yüzde kırmızı kan hücre parçalama sonra pozitif kontrol samp göre ölçülürles bir deterjan ile lize. Bu model sistemde eritrosit membran endo-lizozomal veziküller içine iki tabakalı lipid membran için bir vekil olarak hizmet vermektedir. İstenen sonucu fizyolojik pH (7.4) ve yaklaşık pH 5-6,8 gelen endo-lizozom pH aralığında sağlam hemoliz de ihmal hemoliz olduğunu.
Introduction
Hücre içinde birçok potansiyel yüksek etkili tedavi hedefleri olmasına rağmen, maddelerin hücre içi teslimat önemli bir sorun teşkil etmektedir. Sık sık, ilaçlar, özellikle biyolojik, ekzositoz yoluyla hücreler tarafından içselleştirilmesi ve veziküller içine kaçırılan ya endo-lizozom yolağı yoluyla içindekiler bozulmaya yol açan veya hücrenin geri shuttled vardır vardır. Ikincisi süreçte 1, iç pH veziküllerin enzim aktivitesi için optimum pH olan yaklaşık olarak 5-6 olana kadar asitleştirildi, bu gibi lisozim gibi bu bölme içinde işlev. 2
Son zamanlarda, malzemeleri bir dizi özel bir asitleştirme kendi kargo sitozolik teslim kolaylaştırmak için endozomlar kaldıraç için tasarlanmış edilmiştir. Bu yaklaşımın bir örneği olan temel fizyolojik pH (yani 7.4) zwitteriyonik ve şarj nötr sentetik polimer misel nanopartiküller kullanır. Bununla birlikte, pH 6.0 '- 6.5, polimerler protonlanır olmak ve misel çekirdek oynattığını net pozitif yük kazanma, ve maruz kalan polimer segmentleri ile etkileşim ve endozomal zarı bozar. Bu aktivite, onların sitosolik hedefleri erişim imkanı sağlayan, peptid ve nükleik asit-bazlı terapötiklerin endozomal kaçış teşvik etmek için gösterilmiştir. Membran bariyeri bozmak endozomal kaçış aracılık için geliştirilmiş yöntemlerin diğer örnekleri ya da 3,4 'füzojenik' peptitler yer fosfolipid çift-katlı membran füzyonu veya geçici gözenek oluşumuna aracılık eden proteinlerdir. örneğin poli (propylacrylic asit) gibi anyonik alkil akrilik asit homopolimerleri 5 diğer bir iyi incelenmiş olan bir yaklaşım, ve bu polimerler de, kolye karboksilik asit protonasyon durum geçiş belirler Endo-Lizozomal pH aralıkları bir hidrofobik, membran-yıkıcı devlet. 6,7
Endosomolitik davranışı tarama için yararlı bir model sistem ex in vivo pH bağımlı hemoliz testi. 8 Bu model sistem olarak, eritrosit membranı endo-lizozomal veziküller içine iki tabakalı lipid membran için bir vekil olarak hizmet vermektedir. Bu genellenebilir modeli hücre delici peptidler ve diğer polimerik gen aktarım sistemlerinin endosomolitik davranışlarını değerlendirmek için başkaları tarafından kullanılmaktadır. 8-11 Bu deneyde, insan kırmızı kan hücreleri ve test materyalleri taklit tanımlanan pH'da tampon birlikte kuluçkaya vardır ekstraselüler (7.4), erken (6.8) endozomal ve endo-lizozomal geç (<6.8) ortamları. Kuluçka dönemi sırasında serbest hemoglobin miktar deterjan ile lize pozitif kontrol örneklerinde serbest hemoglobin miktar ile normalize edilir kırmızı kan hücrelerinin lizisi, bir ölçüsü olarak ölçülür.
Potansiyel endosomolitik malzemeleri test küçük bir kütüphane tarama itibaren, bir pH 7.4 hiç hemoliz üretmek örnekleri anlaması, ancak önemli ölçüde yükselmiş etek olabilirpH <6.5 olan olysis, sitozolik ilaç dağıtım için en etkili ve cytocompatible adayları olacak. Bu kriterlere uyan malzemeler gelişigüzel endo-lizozomal bölmeye içselleştirilmesi sonrasında yerel pH bir düşüş maruz kadar iki tabakalı lipid membranlar (sitotoksisite neden olabilir yani) yok eylemsiz değil kalması beklenir.
Bu protokolde, eritrositler bir insan donör izole edilir ve pH 5.6, 6.2, 6.8, ya da deneysel endosomolitik ilaç dağıtım ajanları ile 7.4 'de co-inkübe. Bozulmamış eritrositler peletlenmiş, ve süpernatan (erimiş eritrositler serbest hemoglobin ihtiva eden) bir plaka okuyucu (Şekil 1) vasıtasıyla hemoglobin karakteristik absorbans için analiz edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
endosomolitik fonksiyon için tasarlanmış pH duyarlı polimerler ya da diğer maddeler gibi hızla ve etkili bir şekilde endosome karşılaşılan pH değerlerinde kırmızı kan hücrelerinin lizisi (Şekil 1 esas taranmış olabilir; pH 6.8 – erken endosome, pH 6.2 – geç endosome, pH 5,6 – Lizozom). 14-17 pH bağımlı hemoliz biomacromolecular tedavi (örn. peptidler, siRNA, ODN'ler, proteinler) endozomal serbest arabuluculuk taşıyıcılar yeteneği taranması için kull…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Savunma Bakanlığı aracılığıyla Congressionally Yönetmen Tıbbi Araştırma Programları (# W81XWH-10-1-0445), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH R21 HL110056) ve Amerikan Kalp Derneği (# 11SDG4890030) finanse edersiniz.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco’s PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
- Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
- Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
- Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
- Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
- Behr, J. -. P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
- Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. . Data for Biochemical Research. , (1986).
- Ernst, D. J. . Applied Phlebotomy. , (2005).
- Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
- Lackey, C. A., et al. Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates. Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).
- Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
- Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
- Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
- Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
- Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
- Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
- Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
- Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).
- Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
- Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).
