فيفو السابقين خلية الدم الحمراء الفحص انحلال الدم لتقييم درجة الحموضة التي تستجيب لتسليم وكلاء Endosomolytic عصاري خلوي من أدوية Biomacromolecular
Summary
ويمكن استخدام فحص انحلال الدم كشاشة السريع الإنتاجية العالية، من cytocompatibility نظم لتقديم الأدوية 'والنشاط endosomolytic لنقل البضائع داخل الخلايا. الفحص يقيس تعطل الأغشية كرات الدم الحمراء بوصفها وظيفة من درجة الحموضة البيئية.
Abstract
يمكن طبقات ثنائية فسفوليبيد التي تشكل إندو-الليزوزومية الحويصلات تشكل عائقا أمام تسليم المخدرات البيولوجية لأهداف داخل الخلايا. للتغلب على هذا الحاجز، لقد تم تصميم عدد من ناقلات المخدرات الاصطناعية لتعطيل بنشاط الغشاء endosomal وتسليم البضائع إلى السيتوبلازم. هنا، نحن تصف مقايسة انحلال الدم، والتي يمكن أن تستخدم الشاشة السريع الإنتاجية العالية، لcytocompatibility والنشاط داخل الخلايا endosomolytic من نظم لتقديم الأدوية.
في مقايسة انحلال الدم، وخلايا الدم الحمراء ومواد الاختبار شارك في المحتضنة في مخازن في تعريف بالوسط التي تحاكي خارج الخلية، endosomal في وقت مبكر، وأواخر إندو-الليزوزومية البيئات. بعد الطرد المركزي خطوة لخلايا سليمة بيليه الدم الحمراء، يتم قياس طيفيا كمية الهيموجلوبين تطلق في المتوسط (405 نانومتر لمجموعة ديناميكية أفضل). وكميا في المئة ثم خلايا الدم الحمراء نسبة إلى تعطيل عصيدة مراقبة إيجابيةليه هي lysed مع المنظفات. في هذا النظام النموذجي غشاء كرات الدم الحمراء بمثابة بديل للطبقة ثنائية المادة الدهنية التي إحاطة غشاء إندو-الليزوزومية الحويصلات. النتيجة المرجوة هي انحلال الدم لا يذكر في درجة الحموضة الفسيولوجية (7.4) وانحلال الدم قوية في نطاق درجة الحموضة إندو-الليزوزومية من الرقم الهيدروجيني 5-6،8 تقريبا.
Introduction
على الرغم من أن هناك العديد من إمكانيات عالية التأثير الأهداف العلاجية داخل الخلية، وتسليم من وكلاء داخل الخلايا يشكل تحديا كبيرا. في كثير من الأحيان، يتم إدماج المخدرات، وخاصة البيولوجية، والاتجار من قبل خلايا الحويصلات التي تؤدي إلى إما إلى تدهور محتوياتها من خلال مسار إندو-الليزوزومية، أو مكوكية مرة أخرى خارج الخلية عبر الإيماس. 1 في العملية الأخيرة، ودرجة الحموضة الداخلية من الحويصلات ويحمض إلى 5-6 تقريبا، وهو الرقم الهيدروجيني الأمثل لنشاط الإنزيمات التي تعمل في هذا الحيز، مثل الليزوزيم .. 2
مؤخرا، تم عدد من المواد المهندسة وتحديدا للاستفادة من تحمض الإندوسومات لتسهيل تسليم عصاري خلوي من حمولتها. واحد الأمثلة على هذا النهج يستخدم الاصطناعية، والبوليمر النانوية التي مذيلة الأساسية هي ثنائي الشحنة وهو ورسوم محايدة في درجة الحموضة الفسيولوجية (أي 7.4). ومع ذلك، عند 6.0 درجة الحموضة- 6.5، البوليمرات تصبح البروتونية والحصول على شحنة موجبة صافية أن يزعزع استقرار مذيلة الأساسية، وشرائح البوليمر يتعرض التفاعل مع وتعطيل الغشاء endosomal. وقد تبين هذا النشاط لتعزيز الهروب من endosomal التداوي القائم على حمض النووي الببتيد و، والسماح لهم للوصول إلى أهدافها عصاري خلوي. 3،4 أمثلة أخرى من الطرق وضعت للتوسط الهروب endosomal التي تعطل حاجز الغشاء تشمل 'fusogenic "الببتيدات أو البروتينات التي يمكن أن توسط الانصهار الغشاء أو تشكيل المسام عابرة في طبقة ثنائية فسفوليبيد .. 5 مجموعة السلفات من الأحماض أنيوني الاكريليك ألكيل مثل بولي (حمض propylacrylic) هي مقاربة أخرى مدروسة، وهذه البوليمرات في، الدولة بروتوناتيون من حمض الكربوكسيلية قلادة يملي الانتقال في مسعور، غشاء التخريبية الدولة في نطاقات درجة الحموضة إندو-الليزوزومية. 6،7
نظام واحد نموذجا مفيدا لفحص السلوك هو endosomolytic هX فيفو مقايسة درجة الحموضة التي تعتمد على انحلال الدم. 8 في هذا النظام النموذجي، وغشاء كرات الدم الحمراء بمثابة بديل للطبقة ثنائية المادة الدهنية التي إحاطة غشاء إندو-الليزوزومية الحويصلات. وقد استخدم هذا النموذج للتعميم من قبل الآخرين لتقييم السلوك endosomolytic من اختراق الخلايا الببتيدات وغيرها من أنظمة توصيل الجينات البوليمرية. 8-11 في هذه التجربة، الإنسان خلايا الدم الحمراء ومواد الاختبار شارك في المحتضنة في مخازن في تعريف بالوسط التي تحاكي خارج الخلية (7.4)، في وقت مبكر endosomal (6.8)، وأواخر إندو-الليزوزومية (<6.8) البيئات. وكميا كمية الهيموجلوبين صدر خلال فترة الحضانة كمقياس لتحلل الخلايا الحمراء في الدم، والتي يتم تطبيع لكمية الهيموجلوبين صدر في عينات مراقبة إيجابية هي lysed مع المنظفات.
من فحص مكتبة صغيرة من مواد الاختبار endosomolytic يحتمل، يمكن للمرء أن يستنتج أن العينات التي تنتج أي انحلال الدم في درجة الحموضة 7.4، ولكن تنحنح مرتفعة بشكل ملحوظolysis في درجة الحموضة <6.5، وسوف يكون المرشحين الأكثر فعالية وcytocompatible لتسليم المخدرات عصاري خلوي. ومن المتوقع أن المواد التي تناسب هذه المعايير أن تظل خاملة وليس بشكل عشوائي تدمير الأغشية طبقة ثنائية المادة الدهنية (أي التي يمكن أن تسبب السمسة) حتى التعرض لانخفاض الرقم الهيدروجيني في استيعاب المحلية بعد في إندو-الليزوزومية المقصورات.
في هذا البروتوكول، يتم عزل الكريات الحمراء من المتبرع الإنسان وشارك في حضنت في درجة الحموضة 5.6، 6.2، 6.8، أو 7.4 مع وكلاء التجريبية endosomolytic تسليم المخدرات. الكريات الحمراء سليمة هي مكعبات، ويتم تحليل supernatants (التي تحتوي على الهيموغلوبين أفرج عنه من الكريات الحمراء هي lysed) لامتصاص سمة من الهيموجلوبين عن طريق قارئ لوحة (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن الرقم الهيدروجيني التي تستجيب للبوليمرات أو غيرها من العوامل صممت لتكون وظيفة endosomolytic بسرعة وفعالية فحص يعتمد على تحلل كريات الدم الحمراء عند قيم الرقم الهيدروجيني ووجهت في دخلول؛ جسيم داخلي (الشكل 1؛ درجة الحموضة 6.8 – دخلول؛ جسيم داخلي في وقت مبكر، ودر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يقر تمويل من خلال وزارة الدفاع الكونغرس إخراج برامج البحوث الطبية (# W81XWH-10-1-0445)، المعاهد الوطنية للصحة (NIH R21 HL110056)، وجمعية القلب الأمريكية (# 11SDG4890030).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco’s PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
- Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
- Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
- Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
- Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
- Behr, J. -. P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
- Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. . Data for Biochemical Research. , (1986).
- Ernst, D. J. . Applied Phlebotomy. , (2005).
- Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
- Lackey, C. A., et al. Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates. Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).
- Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
- Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
- Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
- Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
- Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
- Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
- Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
- Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).
- Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
- Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).
