Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying
Summary
Comet assay alkali labil siteleri ve hipokampal nöronlar da dahil olmak üzere tüm hücrelerde DNA üzerinde DNA-DNA/DNA-protein çapraz bağlantılar dahil tek ve çift zincir kırıkları, tespit etmenin en etkin yoludur. Yöntem DNA hasar miktarının farklılıklara bağlı olarak, bir elektrik alanı içinde DNA diferansiyel göç yararlanır.
Abstract
Ilaçların bir dizi DNA onarım yolakları hedef ve hücre DNA hasarı oluşturarak öldürmeye teşvik. Böylece, doğrudan DNA hasarı ölçmek için süreçlerin kapsamlı değerlendirilmiştir. Geleneksel yöntemler zaman alıcı, pahalı, kaynak yoğun ve kopyalayan hücrelerin gerektirir. Buna karşılık, kuyruklu testi, tek hücre jel elektroforezi testi, DNA hasarı ve onarımı daha hızlı, non-invaziv, ucuz, direkt ve duyarlı bir ölçüsüdür. DNA hasarı yanı sıra DNA tamir bütün formları bu güçlü tekniği kullanarak tek hücre düzeyinde görüntülenebilir.
Comet assay yatan prensip DNA hasarı bu organizasyon bozan ise intakt DNA çok sipariş olmasıdır. Hasarlı DNA'nın agaroz matriks içine girer ve bir elektrik alanına maruz kaldığında, negatif yüklü DNA pozitif yüklüdür katoda doğru göç eder. Büyük hasarsız DNA ipliklerini çok çekirdek göç etmek mümkün değildir. DNA hasaruzak bozulmamış DNA daha seyahatlerinizde küçük DNA parçaları oluşturur. Comet Assay, bir görüntü analiz yazılımı, tedbirler ve çekirdeğin dışına göç etmiş DNA ile DNA'dan genel floresan yoğunluğu karşılaştırır. Göç DNA'dan Floresan sinyal DNA hasarı ile doğru orantılıdır. Uzun parlak DNA kuyruk artmış DNA hasarı anlamına gelir. Ölçülen parametreler bazıları kuyruk DNA'sının miktarı ve kuyruk, kuyruk uzunluğundaki DNA dağıtımı ve DNA yüzdesi her ikisi de bir ölçüsüdür kuyruk an vardır. Bu testte DNA hasarının çözünürlüğü tamir yerini almıştır anlamına beri yanı DNA onarım ölçmek için sağlar. Duyarlılık sınırı diploid memeli hücre 1,2 başına yaklaşık 50 iplikli kırılır. Örneğin etoposid gibi herhangi bir DNA hasarına neden olan ajan ile muamele Hücreler, bir pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. Böylece comet assay DNA hasarı ölçmek için hızlı ve etkili bir yöntemdir.
Protocol
Discussion
Comet assay bireysel hücrelerin analiz eşsiz kapasitesine sahiptir. Bu sitotoksik ajanlara diferansiyel tepki göstermek hücrelerinin alt popülasyonlarının belirlenmesi avantajlıdır. Birkaç pratik sınırlamaları dikkate alınmalıdır. Ayrı ayrı değerlendirilebilir hücrelerin sayısı her bir bağlı olarak değişebilir. Bir popülasyon içindeki DNA hasarı varyans varsa örneklem büyüklüğü artırılmalıdır. Nekrotik ya apoptotik hücrelerin baskın varlığı hata katacak yana Yaşayabilir tek h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Radyasyon Onkolojisi, Alabama-Birmingham Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi'nde, Dövüş Çocuk Kanser Vakfı ve Gabrielle'in Angel Vakfı (ESY için.) Bölümü IMPACT Ödülü ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O’Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. . Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
