Summary

Assaying ניזק לדנ"א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

Published: December 19, 2012
doi:

Summary

Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ"א.

Abstract

מספר התרופות למקד את מסלולי תיקון DNA ולגרום לתא הורג על ידי יצירת ניזק לדנ"א. לפיכך, תהליכים ישירות למדידת ניזק לדנ"א נבדקו בהרחבה. שיטות מסורתיות הן זמן, משאבים רבים, יקרים אינטנסיביים ודורשות תאים משתכפלים. לעומת זאת, בדיקת השביט, assay אלקטרופורזה ג'ל תא בודד, הנה אמצעי מהיר, לא פולשנית, זול, ישיר ורגיש של ניזק לדנ"א ותיקון. כל הצורות של ניזק לדנ"א, כמו גם תיקון DNA יכולות להיות דמיינו ברמת התא הבודדה באמצעות טכניקה זו עצמה.

העיקרון העומד ביסוד assay השביט הוא שדנ"א שלם הוא הורה מאוד ואילו ניזק לדנ"א משבש את הארגון הזה. מחלחל לתוך DNA הפגום agarose המטריצה ​​וכאשר נתון שדה חשמלי, ה-DNA הטעון שלילי נודד לכיוון הקתודה הטעונה במטען חיובי. את גדילי הדנ"א הניזוק הגדולים אינם מסוגלים להעביר רחוק מהגרעין. ניזק לדנ"איוצר מקטעי דנ"א קטנים שנוסעים רחוק יותר מאשר ה-DNA בשלמותה. השביט Assay, תוכנת תמונת ניתוח, אמצעים ומשווה את עוצמת הניאון הכוללת של ה-DNA בגרעין עם DNA שהגר אל מחוץ לגרעין. אות ניאון מהדנ"א הגר פרופורציונלית לניזק לדנ"א. זנב דנ"א כבר בהיר מסמל גדל ניזק לדנ"א. חלק מהפרמטרים שנמדדו הוא רגע זנב שהוא מדד של שניהם כמות ה-DNA וההפצה של ה-DNA בזנב, אורך הזנב והאחוז של ה-DNA בזנב. בדיקה זו מאפשרת למדוד תיקון DNA גם מאז רזולוציה של ניזק לדנ"א מסמנת תיקון התרחש. המגבלה של רגישות היא כ 50 הפסקות גדיל ל1,2 התא דיפלואידי יונקים. תאים שטופלו עם כל סוכנים מזיקים DNA, כגון etoposide, יכולים לשמש כביקורת חיובית. כך assay השביט הוא הליך מהיר ויעיל למדידת ניזק לדנ"א.

Protocol

1. תא תרבות תאי תרבות עצביים ולטפל בם כנדרש. תאי קציר לתוך צינורות 15 מ"ל: תקשורת לשאוב, לשטוף עם פוספט נאגרו מלוח (PBS, סידן ומגנזיום חינם), להוסיף טריפסין, לאסוף בצינורות 15 מ"ל, ולנטרל את טרי…

Discussion

Assay השביט יש את היכולת הייחודית של ניתוח תאים בודדים. זהו יתרון בזיהוי של אוכלוסיות של תאים הממחישות תגובת הפרש לסוכנים ציטוטוקסיות. כמה מגבלות מעשיות צריכות להילקח בחשבון. מספר התאים שניתן להעריך בנפרד עשוי להשתנות בהתאם לפרט. גודל המדגם צריך להיות מוגבר אם יש שונה ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בפרס IMPACT מהמחלקה לאונקולוגיה קרינה, אוניברסיטת אלבמה-בירמינגהם המקיף במרכז הסרטן, קרן הסרטן של לחימת הילדים, ואנג'ל הקרן של גבריאל (לESY.) על ידי.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments (optional)
1.5 ml tubes Santa Cruz Biotechnology, Inc Sc-200271
10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) Fisher Scientific BP13331
15 ml tube Fisher Scientific 0553851
Agarose Sigma A5093
Aluminum foil Fisher Scientific 01213101
Beaker Fisher Scientific FB102300
Centrifuge Thermo Scientific 75004261PR
Comet Assay software Comet Assay IV Image Analysis System
Cylinder Fisher Scientific 08555F
EDTA GIBCO 15575
Electrophoresis chamber Thermo Scientific 09528101
Ethanol Fisher Scientific A407P4
Fluorescent microscope Zeiss Axio Vision Any fluorescent microscope with green filter will suffice
Hemacytometer Fisher Scientific 0267152
Low melting point agarose Promega V2111
Microwave Sears
Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free HyClone SH3025601
Power supply BioRad 1645050
Refrigerator Sears
Ruler Staples
Slide Fisher Scientific 12550143
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium hydroxide Sigma S5881
Sodium lauryl sarcosinate Fisher Scientific S529
Sybr green Invitrogen S7585
Tray Fisher Scientific 15242B
Tris Base Sigma T6066
Triton-X 100 Sigma T8787
Trypsin HyClone SH3023601
Vortex Fisher Scientific 02216108
Water bath Fisher Scientific 154622Q

References

  1. Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
  2. Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
  3. Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
  4. Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
  5. Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
  6. Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
  7. Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
  8. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
  9. Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O’Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
  10. Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
  11. Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
  12. Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
  13. Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
  14. Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
  15. Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
  16. Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
  17. Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
  18. Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
  19. Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
  20. Electrophoresis, F. I., et al. . Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
  21. Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).

Play Video

Cite This Article
Nowsheen, S., Xia, F., Yang, E. S. Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay. J. Vis. Exp. (70), e50049, doi:10.3791/50049 (2012).

View Video