As medições da função do músculo contribui para a avaliação de potenciais agentes terapêuticos para o músculo patologia, bem como para a determinação dos mecanismos subjacentes à fisiologia desse tecido. Vamos demonstrar a preparação do extensor longo dos dedos e músculos do diafragma para testes funcionais. Protocolos para contrações isométricas e excêntricas será mostrado, bem como as diferenças de resultados entre os músculos distróficos, representando um estado patológico, e os músculos de tipo selvagem.
Crítico para a avaliação de potenciais agentes terapêuticos para a doença muscular são sensíveis e reprodutíveis avaliações fisiológicas da função muscular. Porque muitos ensaios pré-clínicos confiam em modelos de mouse para estas doenças, a função muscular isolado tornou-se um dos padrões para Go / NoGo decisões em movimento candidatos da droga para a frente em pacientes. Iremos demonstrar a preparação do extensor digitorum longus (EDL) e músculos do diafragma para testes funcionais, que são os músculos predominantes utilizados para estes estudos. A geometria do músculo EDL é ideal para preparações de músculo isolado, com dois tendões facilmente acessíveis, e um tamanho pequeno, que pode ser suportado por superfusão de um banho. O diafragma apresenta profunda patologia progressiva em animais distróficos, e pode servir como uma plataforma para avaliar muitas terapias potenciais contrariando fibrose, e promover a estabilidade fibromuscular. Protocolos para testes de rotina, incluindo isométrica e excêntricacontrações TRIC, será mostrado. Força isométrica fornece a avaliação da resistência, e as contracções excêntricas ajudar a avaliar a estabilidade do sarcolema, que é interrompida em diversos tipos de distrofias musculares. As comparações dos resultados esperados entre os músculos de tipo selvagem e os músculos distróficos também será fornecida. Estas medidas podem complementar as medições morfológicas e bioquímicas da homeostase do tecido, bem como a avaliação de animais inteiros da função muscular.
As medições da função do músculo contribui para a avaliação de potenciais tratamentos para patologias do músculo, assim como para a determinação dos mecanismos subjacentes à fisiologia desse tecido. Para doença muscular, o uso de modelos de ratos se tornaram um componente central para a compreensão das ligações entre genótipo e fenótipo, e para estender esse conhecimento para o desenvolvimento e teste de terapêuticas potenciais. As distrofias musculares, em particular, basearam-se em ratos, para avaliar estes agentes e estabelecer dados pré-clínicos necessários para avançar para ensaios clínicos em doentes. A medida do resultado frequente usa a função do músculo cardíaco isolado para determinar a força, a qual é aplicável a uma ampla gama de estudos. Outra medida é a utilização de excêntricos, ou alongamento, contracções para determinar as alterações na integridade da membrana muscular, o que é deficiente na distrofia muscular de Duchenne, eo modelo de rato desta doença (mdx). Portanto, é essencial para estes tipos de measurementos para ser sensível e reprodutível.
O rato extensor digitorum longus (EDL) do músculo tem sido amplamente utilizado para a função do músculo cardíaco isolado, devido à sua geometria e tamanho ideal, incluindo a orientação das fibras uniforme e tendões definitivas 2, 5, 6, 10, 12. Métodos para músculos EDL medições isométricas funcionais foram descritos numa publicação anterior JoVE 8, bem como na SOP Treat-NMD 1. Nós estendemos a descrição destes métodos para incluir tanto contrações isométricas e excêntricas. Características da doença são evidentes no EDL, incluindo os ciclos heighted de degeneração / regeneração e produção de força diminuída.
O diafragma de rato apresenta a progressão mais rápida patológica de distrofia muscular em comparação com outros músculos do rato 11. Aos 6 meses de idade, fibrose cumulativa compreende aproximadamente 50% do músculo. Isto resulta em significativamente diminuissed produção de força 11. Portanto, agentes terapêuticos que podem impedir a infiltração fibrótica pode ser avaliada de forma eficiente no diafragma.
A perda da distrofina no músculo leva ao aumento da fragilidade e danos contráctil aumentada em todos os 9 músculos. Portanto, muitas terapias para a distrofia muscular de Duchenne são voltadas para a substituição da distrofina. Como tal, um ensaio que se tornou essencial para a avaliação destas estratégias é a contração excêntrica, que podem distinguir entre o músculo normal e distrófica, bem como determinar o que beneficiem de uma estratégia particular, para proteger um músculo distrófico de danos contrátil 2, 3, 4, 12. Este procedimento requer um duplo modo de servo-motor, que é capaz de modular / registo de tamanho e força, ou por um método de ajustar o comprimento rapidamente separado a partir de um transdutor de força.
O objetivo deste artigo é fornecer orientação para a execução da função muscular isolado em dois músculos de camundongos – a EDL e do diafragma. A avaliação destes músculos pode fornecer informações sobre se deve ou não candidatos terapêuticos para a doença muscular são benéficas. Para ambos os músculos, o principal fator na obtenção de dados consistentes que uma dissecação limpa. Portanto, praticando e aperfeiçoando o passo isolamento inicial é essencial antes de passar para testes funcionais. Além disso, o estabelecimento de parâmetros funcionais para muscular normal é fundamental antes de fazer comparações com o músculo distrófico, ou entre os tratamentos. Isto irá assegurar que os resultados do estudo não estão sujeitos a variabilidade conferida pela capacidade da pessoa que realiza as experiências. O uso de um corante impermeante de membrana podem ajudar com a optimização da preparação de dissecação, para a incubação de qualquer músculo, em uma solução que contém um tal corante irá marcar a maioria das fibras danificadas, e pode servir como um indicador de dissection sucesso. Minimizar o número de fibras danificadas no músculo irá ajudar a otimizar a medição. As fibras danificadas por dissecção fluorescência muito mais intensamente do que os danos por contracção excêntrica, e por isso, se o corante é também usado durante o processo de mecânica, pode-se usar a intensidade do corante para distinguir entre os dois tipos de danos.
Dissecação de tiras de membrana terá sempre os danos nas fibras, simplesmente porque, cortando ao longo do comprimento das fibras, inevitavelmente algumas são destruídas. A absorção do corante é forte em que essas fibras danificadas, e estas são normalmente restringida às arestas exteriores da preparação. Em média, observa-se uma banda de fibras danificadas isto é ~ 3 fibras de largura (~ 120 mm) de cada lado da tira de músculo. Se a faixa danificada compreende mais de 15% do músculo, em seguida, os dados são descartados. A preparação diafragma também tem restrições sobre o tamanho ideal para as medidas funcionais. Encontraram-se que os pedaços de diaphragm que são maiores do que 5 mm começam a dobrar-se sobre si mesmos, porque o empate tendão central é apenas em um ponto. Isto resulta numa diminuição da força específica na preparação. Verificámos também que as tiras mais estreitas também têm menor força específica, que acreditamos ser visto que o número de fibras que foram danificados durante a dissecção compreendem uma maior proporção do número total de fibras. Por exemplo, se 0,1 milímetros de cada lado está danificado e, em seguida, que é de 5% (2×0.1 mm / 4 tira mm) da preparação de músculo que não contribui para a força, enquanto que, se a tira é apenas 1 mm, em seguida, 20 % da preparação de músculo está danificado. Assim, tanto a largura da região danificada, bem como a largura de toda a preparação são factores importantes para controlar.
As medições de tensão isométrica máxima requerem que todas as fibras musculares em um músculo é estimulado. Uma vez que há uma grande variedade na dos componentes de um aparelho de funcionamento, isto deve ser determinado para cada conjunto individual-se. Por exemplo, o tamanho do banho ou do tipo de estimulador pode afectar a intensidade da estimulação. Estimulação Twitch é uma forma razoável para determinar as condições de estimulação supramáximos. Uma vez que esta é estabelecida por uma configuração específica e muscular, ele pode ser utilizado para estudos posteriores.
Em contrapartida, o comprimento óptimo de qualquer músculo dado tem de ser medida para cada preparação utilizando o processo iterativo descrito acima. Isto assegura que não há sobreposição de filamentos grossos e finos são ideais e a capacidade de produção máxima potencial força é medida. Os processos alternativos podem contar com os padrões de difracção associados com as estrias do músculo, mas isso requer equipamento adicional não descrito aqui.
Rotineiramente usar 500 durações estimulação ms, que cai na faixa média deste parâmetro utilizado por outros investigadores nesta área. Embora isto possa causar alguma fadiga do músculo durante a contracção, o que é evidentepor um "sag" na produção de força máxima, isso por si só pode ser informativo. Por exemplo, uma diferença de fadiga pode ser obtida por diferentes tipos de terapias, incluindo aqueles manuseamento de cálcio que, portanto, o objectivo de sag em vigor durante a contracção activo pode servir como um indicador de melhoria. Em alternativa, a perda de força pode indicar que as suturas nos tendões não são suficientemente apertado, e que são o escorregamento durante a contracção. O músculo devem ser removidos a partir do banho e as suturas devem ser re-ligada se isto ocorre. Nós também utilizar uma série de 3 contracções tetânica, o que ajuda a estimar a estabilidade da preparação. Mais uma vez, deslizamentos de sutura levaria à perda de força entre as contrações, requerendo sutura re-subordinação. Grandes músculos também pode gerar núcleos anóxicas, que levam a perdas de força durante o protocolo. Tamanho muscular é um fator limitante para a realização de testes de função muscular isolado, onde os músculos EDL com massas superiores a 20 mg perder força a cada contraçãoção, e não pode ser suportado por superfusão de um banho. Tiras de membrana não sofrem as mesmas complicações porque são suficientemente fina para que a viabilidade prolongada no banho.
Outros músculos podem ser utilizados para a função do músculo cardíaco isolado, incluindo o músculo sóleo, que é comumente utilizada, mas não descritas aqui. Muitos dos mesmos procedimentos podem ser adoptados para o sóleo, em termos de preparação e os testes funcionais. No entanto, as principais diferenças estão na freqüência de estimulação, e os parâmetros para contrações excêntricas. Utilização dos sóleo de função complementa a dos outros dois músculos, e por isso deve ser considerado como parte de um "pacote" de avaliação camundongos distróficos 4, 7.
Contração excêntrica proporciona um índice de fragilidade contráctil, e é importante o uso de um protocolo que resulta em perda de força modesta em músculos de animais de tipo selvagem e de uma perda significativa da força nasnão tratados músculos distróficos para que haja uma ampla faixa dinâmica para comparações. A falta de qualquer perda de força nos músculos normais sugerem que a contração excêntrica é muito leve, e não será suficiente para distinguir entre as terapias que não são eficazes e as que são realmente benéfica. No entanto, uma perda dramática de força nos músculos normais submetidos a contração excêntrica pode ser muito grande para trazer à tona diferenças associadas com a doença. O protocolo para o EDL e diafragma utiliza uma taxa de estiramento 0,5 Lo / sec para produzir uma alteração de comprimento de 10%. Nós normalmente executam 5 contrações excêntricas, que resultam em uma pequena perda de força nos músculos normais e uma significativa perda de força nos músculos distróficos. Certamente, todos estes parâmetros podem ser variados para aumentar o comprimento global mudança, a taxa de estiramento, ou o número de contracções excêntricas para distinguir diferenças entre músculo doente e saudável, bem como sobre os efeitos de um tipo específico de mutação ou tratamento um está estudando. Enquanto não existe uma diferença marcada entre os músculos normais e doentes, então existe um padrão de ouro para alcançar em termos de tratamentos.
Em resumo, este protocolo estabelece as diretrizes para a realização de contrações isométricas e excêntricas, e espero que identifica os potenciais armadilhas a evitar quando definir esta técnica em seu laboratório.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela D. Paulo Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
in vitro Muscle Test System | Aurora Scientific | 1200A | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
Dumont SS forceps – angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
Medical tape | Transpore | 3M | |
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |