מדידות תפקוד שרירים תורמות להערכה של השרירים רפויים פוטנציאלי לפתולוגיה, כמו גם לקביעת מנגנונים בבסיס פיזיולוגיה של רקמה זו. נדגים הכנת longus extensor digitorum שרירי סרעפת ובדיקה פונקציונלית. יוצגו פרוטוקולים להתכווצויות איזומטרי ואקסצנטריות, כמו גם הבדלים בתוצאות בין שרירי dystrophic, המייצגים מצב פתולוגי, ושרירי wildtype.
קריטי להערכה של תרופות פוטנציאליות למחלת שרירים הם הערכות פיסיולוגיות רגישות ולשעתק של תפקוד שרירים. בגלל ניסויים טרום קליניים רבים מסתמכים על מודלי עכבר למחלות אלה, תפקוד שרירים מבודד הפך לאחד את הסטנדרטים להחלטות Go / NoGo בהעברת סמי מועמדים קדימה לחולים. נדגים הכנת longus extensor digitorum (אדי) ושרירי סרעפת לבדיקות פונקציונליות, שהם השרירים הבולטים מנוצלים ללימודים אלה. גיאומטרית שריר האד היא אידיאלית להכנות שרירים מבודדות, עם שני גידים נגיש בקלות, וגודל קטן שיכול להיות נתמך על ידי superfusion באמבטיה. הסרעפת מציגה הפתולוגיה מתקדמת עמוקה בחי dystrophic, ויכולה לשמש כפלטפורמה להערכת טיפולים פוטנציאליים רבים מאבק בסיסטיק, וקידום יציבות myofiber. פרוטוקולים לבדיקה שגרתית, כולל איזומטרי וeccenהתכווצויות tric, יוצגו. כוח איזומטרי מספק הערכה של כוח, והתכווצויות אקסצנטריות לעזור להעריך יציבות sarcolemma, ששבשה בסוגים רבים של ניוון שרירים. השוואות של התוצאות הצפויות בין שרירים משרירי wildtype וdystrophic גם תהיינה מסופקת. אמצעים אלה יכולים להשלים מדידות מורפולוגיות וביוכימיים של הומאוסטזיס רקמות, כמו גם הערכות של בעלי חיים שלמות של תפקוד שרירים.
מדידות תפקוד שרירים תורמות להערכת טיפולים פוטנציאליים לשרירי פתולוגיה, כמו גם לקביעת מנגנונים בבסיס פיזיולוגיה של רקמה זו. למחלת שרירים, השימוש במודלים של עכברים הפך למרכיב מרכזי להבנת הקשר בין גנוטיפ ופנוטיפ, ולהעמקת ידע שלתכנון והבדיקה של תרופות פוטנציאליות. את ניוון השרירים, בפרט, יש לסמוך על עכברים כדי להעריך הסוכנים הללו וליצור נתונים טרום קליניים הנדרשים להתקדם לניסויים בחולים. מדד תוצאה תכופה משתמש בתפקוד שרירים מבודדים כדי לקבוע כוח, אשר חל על מגוון רחב של מחקרים. מדד נוסף הוא השימוש באקסצנטרי, או התארכות, התכווצויות לקבוע שינויים בשלמות קרום שריר, שהוא לוקה במחלת ניוון שרירים דושנה, ומודל עכברי למחלה זו (MDX). לכן, זה הכרחי עבור אלו סוגים של measuremמציג להיות רגיש לשחזור.
Longus עכבר extensor digitorum (אדי) השריר כבר בשימוש נרחב לתפקוד שרירים מבודד בשל הגיאומטריה שלו אידיאלית והגודל, כולל נטייה אחידה סיבים וגידים מוחלטים 2, 5, 6, 10, 12. שיטות לשרירי אדי מדידות פונקציונליות איזומטרי תוארו בפרסום קודם יופיטר 8, כמו גם ב1 SOP טריט-NMD. הרחבנו את התיאור של שיטות אלה כדי לכלול את שני צירים איזומטרי ואקסצנטריים. סימני היכר של מחלה ניכרים באד, לרבות מחזורי heighted של ניוון / התחדשות ותפוקת כוח מצומצמת.
סרעפת העכבר מציגה את ההתקדמות פתולוגית המהירה ביותר של ניוון שרירים בהשוואה לשרירים אחרים בעכבר 11. בגיל 6 חודשים, סיסטיק המצטבר מהווה כ 50% מהשריר. כתוצאה מכך באופן משמעותי impaireפלט ד כוח 11. לכן, סוכנים טיפוליים שיכול למנוע חדירת fibrotic ניתן להעריך ביעילות בסרעפת.
אובדן הדיסטרופין בשריר גורם לשבירות מוגברת וניזק מוגבר בכל התכווצות השרירים 9. לכן טיפולים רבים למחלת ניוון שרירים דושן מיועדים להחלפת הדיסטרופין. ככזה, assay שהפך חיונית להערכת אסטרטגיות אלה הוא כיווץ אקסצנטרי, שיכול להבחין בין השרירים נורמלים וdystrophic, כמו גם לקבוע מה התועלת באסטרטגיה מסוימת יש להגנה על שריר dystrophic מניזק כויץ 2, 3, 4, 12. הליך זה מחייב גם סרוו מנוע כפול במצב שיכול להשפיע על אורך / ושיא כוח, או בשיטה של התאמת אורך מהירות נפרד ממתמר כוח.
המטרה של מאמר זה היא לספק הדרכה לביצוע תפקוד שרירים מבודד בשני שרירים מעכברים – edl והסרעפת. הערכה של שרירים אלה יכול לספק תובנה אם צנרת תרופות למחלת שרירים מועילות. לשני שרירים, הגורם המרכזי בקבלת נתונים חזקים הוא נתיחה נקיה. לכן, תרגול ושכלול צעד הבידוד הראשוני חיוני לפני שעבר על בדיקות פונקציונליות. בנוסף, הקמת אמות מידה פונקציונליות לשרירים נורמלים היא קריטית לפני ביצוע השוואות לשרירי dystrophic, או בין טיפולים. זה יבטיח כי תוצאות המחקר אינן כפופות להשתנות גבוהה שהקנתה את היכולת של האדם שבצע את הניסויים. השימוש בצבע impermeant קרום יכול לעזור בביצוע אופטימיזציה להכנת הנתיחה, לדגירה של כל שריר בתמיסה המכילה צבע כזה יציין סיבים פגומים ביותר, ויכול לשמש כמדד דהצלחת issection. צמצום מספרם של סיבי השריר שהניזוק ביעזור לייעל את המדידה. את הסיבים שניזוקו על ידי נתיחה לזרוח הרבה יותר בהירים מאלה נפגעו על ידי כיווץ אקסצנטרי, ולכן אם לצבוע הוא גם משמש בתהליך המכניקה, אפשר להשתמש בעוצמת הצבע כדי להבחין בין שני סוגים של ניזק.
נתיחה של רצועות סרעפת כמעט תמיד יש ניזק סיבים, פשוט כי על ידי החיתוך לאורך הסיבים, חלק בלתי נמנע לקבל נהרס. ספיגת דאי היא חזקה בסיבים הפגומים האלה, ואלה בדרך כלל מוגבלים לשולים החיצוניים של ההכנה. בממוצע, אנו רואים להקה של סיבים שהניזוק שהם ~ 3 סיבים ברוחב (~ 120 מיקרומטר) משני צדי רצועת השריר. אם הלהקה הפגומה מונה יותר מ 15% של השרירים, אז הנתונים נמחקים. הכנת הסרעפת יש גם מגבלות על הגודל אופטימלי לפעולות פונקציונליות. אנחנו גילינו שחתיכות של דiaphragm שהם רחבים יותר מ 5 מ"מ מתחיל לקפל בעצמם, כי עניבת הגיד המרכזית היא רק בנקודה אחת. התוצאה הוא הירידה בכוח מסוים בהכנה. גם אנחנו גילינו שרצועות צרות יותר יש גם כוח סגולי נמוך, אשר אנו מאמינים היא כי המספרים של סיבים שניזוקו במהלך הנתיחה מהווים חלק גדול יותר ממספר הסיבים הכוללים. לדוגמה, אם 0.1 מ"מ בכל צד פגום, שעומד על 5% (2×0.1 מ"מ / 4 רצועת מ"מ) של הכנת השרירים שאינו תורמים לכוח, בעוד שאם הרצועה היא רק 1 מ"מ, ולאחר מכן 20 % מהכנת השריר פגומים. לפיכך, גם את רוחבו של האזור הפגוע, כמו גם הרוחב של כל ההכנות הם גורמים חשובים כדי לשלוט.
מדידות של מתח איזומטרי מרבי מחייבות שכל סיבי השריר בשריר המגורה. מכיוון שקיימות שונות עצומות ברכיבים של מנגנון לתפקד, זה צריך להיקבע לכל קבוצת פרטעד. לדוגמה, גודל אמבטיה או הסוג של גירוי יכול להשפיע על עוצמת הגירוי. גירוי עווית הוא דרך סבירה כדי לקבוע תנאי גירוי supramaximal. ברגע שזה הוקם להתקנה ושרירים ספציפיים, זה יכול להיות מנוצל עבור מחקרים עוקבים.
לעומת זאת, האורך האופטימלי של כל שריר נתון צריך להימדד עבור כל הכנה באמצעות תהליך איטרטיבי שתואר לעיל. הדבר זה מבטיח שחפיפת נימה עבה ודקה היא אופטימלית וכושר הייצור הפוטנציאלי המקסימאלי כוח נמדד. הליכים חלופיים יכולים להסתמך על דפוסי התאבכות הקשורים לפסי השרירים, אבל זה דורש ציוד נוסף שלא תאר כאן.
אנו משתמשים באופן שגרתי 500 משכי גירויי msec, אשר נופלים בטווח ביניים של פרמטר זה בשימוש על ידי חוקרים אחרים בתחום זה. למרות שזה עלול לגרום לעייפות מסוימת של השריר במהלך ההתכווצות, אשר באו לידי ביטויעל ידי "סאג" בהפקת הכח המרבית, זה בעצמו יכול להיות אינפורמטיבי. לדוגמה, הבדל בעייפות יכול להיות מושגת על ידי סוגים שונים של טיפולים כוללים אלה שטיפול סיד היעד, ומכאן לשקוע בתוקף במהלך ההתכווצות פעילה יכול לשמש כמדד לשיפור. לחלופין, אובדן הכח יכול להצביע על כך שהתפרים בגידים הם לא מספיק חזקים, ושהם החליקו במהלך ההתכווצות. השרירים יש להסיר מן האמבטיה והתפרים יש קשר באם זה קורה. אנו משתמשים גם בסדרה של 3 התכווצויות tetanic, שעוזרת להעריך את היציבות של ההכנה. שוב, תלושי תפר יובילו לאובדן של כוח בין צירים, הדורשים תפירה מחדש קשירה-. שרירים גדולים יכולים גם לייצר ליבות anoxic, שיוביל להפסדים בכח בפרוטוקול. גודל שריר הוא גורם מגביל לביצוע בדיקות תפקוד שרירים מבודדות, שבו שרירי אד עם מסה גדולה מ 20 מ"ג מאבדים כוח עם כל Contraction, ולא יכול להיות נתמך על ידי superfusion באמבטיה. רצועות סרעפת לא סובלות מאותם סיבוכים כי הם דקים מספיק כדי להיות כדאיות ממושכת באמבטיה.
שרירים אחרים יכולים להיות מנוצלים לתפקוד שרירים מבודד, לרבות שריר soleus, המשמש בדרך כלל, אבל לא תארו כאן. רבים מאותם הנהלים יכולים להיות מאומצים על soleus במונחים של ההכנה והבדיקה הפונקציונלית. עם זאת, ההבדלים העיקריים הם בתדר הגירוי, ואת הפרמטרים להתכווצויות אקסצנטריות. השתמש של soleus לפונקציה שמשלים את שני שרירים האחרים, ולכן הוא צריך להיחשב כחלק מחבילה "סטנדרטית" להערכת עכברי dystrophic 4, 7.
כיווץ אקסצנטרי מספק מדד השבריריות התכווצות, וזה חשוב להשתמש בפרוטוקול שגורם לאובדן צנוע של כוח בשרירים מחי wildtype ואובדן משמעותי של כוח בשרירי dystrophic לא טופלו, כך שיש טווח דינמי רחב להשוואות. חוסר כל אובדן כוח בשרירים נורמלים מרמז כי הכיווץ האקסצנטרי הוא קל מדי, ולא יהיה מספיק כדי להבחין בין טיפולים שאינם יעילים ואת אלו שהם באמת מועילים. עם זאת, הפסד דרמטי בכוח בשרירים נורמלים הנתון לכיווץ אקסצנטרי עלול להיות גדול מדי כדי להקניט את הבדלים הקשורים במחלה. הפרוטוקול שלנו לedl והסרעפת משתמש בשיעור 0.5 Lo / שנייה למתוח כדי לייצר 10% שינוי אורך. אנחנו בדרך כלל לבצע 5 התכווצויות אקסצנטריות, שתוצאה בהפסד קטן של כוח בשרירים נורמלים ואובדן משמעותי של כוח בשרירי dystrophic. אין ספק, כל הפרמטרים הללו יכול להיות מגוונים כדי להגדיל את אורך השינוי הכולל, בשיעור של מתיחה, או במספר ההתכווצויות אקסצנטריות כדי להבחין בהבדלים בין שריר חולה ובריא, כמו גם על השפעת סוג מסוים של מוטציה או לאreatment אחד לא לומד. כל עוד יש הבדל ניכר בין שרירים בריאים וחולים, אז יש תקן זהב להגיע למונחים של טיפולים.
לסיכום, פרוטוקול זה מקובע הנחיות לביצוע התכווצויות איזומטרי ואקסצנטריות, ואני מקווה שמזהה את המלכודות הפוטנציאליות להימנע בעת הגדרת טכניקה זו במעבדה שלך.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי פול ד Wellstone השיתופי מרכז המחקר (AR052646).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
in vitro Muscle Test System | Aurora Scientific | 1200A | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
Dumont SS forceps – angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
Medical tape | Transpore | 3M | |
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |