Bu yazıda, akut izole beyin dilimleri arasında nöronlarda ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için kullanışlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, standart yama kelepçe teknikler kullanılarak kaydedilmiş nöronlar için ilaçların lokal uygulama için bir ilacın dolu bir mikropipet kullanımını içerir.
Tütün kullanımı kanser, kalp hastalığı, amfizem, ve inme gibi birçok sağlık sorunlarına yol açar. Sigara bağımlılığı merkezi sinir sistemi boyunca nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChRs) nikotinin biyofiziksel ve hücresel faaliyetler kaynaklanıyor yaygın bir nöropsikiyatrik bozukluktur. Nikotin bağımlılığı ile ilgili beyin bölgelerinde mevcut çeşitli nAChR alt anlamak önemli bir önceliktir.
Bu tür bütün-hücre yama klempi veya iki elektrotlu voltaj kelepçesi elektrofizyolojik kayıtları gibi teknikleri kullanan deneyler ilgi nAChRs farmakolojik karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tür memeli doku kültürü hücreleri veya Xenopus laevis oosit olarak Hücreler ifade nAChRs, fiziksel olarak izole edilir ve bu nedenle kolayca modern farmakoloji araçları kullanılarak incelenmiştir. Hedef reseptör zaten bilinen, özellikle çok gelişme, bu teknikler kullanılarak yapılmış birnd ektopik ifade kolayca elde edildi. Akut laboratuar fareleri ya da sıçanlar hasat beyin kesitleri içinde nöronlarda: Ancak, çoğu zaman kendi doğal ortamında nAChRs incelemek için gereklidir. Örneğin, bu tür fareler α4 L9'A fareler 1 ve α6 L9, 2'S fareler gibi "duyarlı" nAChR alt üniteleri ifade eden, spesifik nAChR alt birim olan fonksiyonel ekspresyonu esas nöronların kesin tanımlanması için izin verir. Beyin dilimleri içerisinde nöronlardan gelen tüm-hücre yama klemp kayıtları rutin yetenekli elektrofizyolog tarafından yapılmasına rağmen, yerel olarak böyle asetilkolin veya bir beyin dilim içinde kaydedilen hücreye nikotin gibi ilaçların uygulamak zordur. Superfusate içine ilaçların seyreltilmesi (banyo uygulaması) hızla geri dönüşü yoktur, ve U-tüp sistemleri kolayca beyin dilimleri ile çalışmak için adapte değildir.
Bu yazıda, hızla yetişkin m Kaydedilen nöronlar nAChR-aktive edici ilaçları uygulamak için kullanılan bir yöntem tarifbeyin dilimleri Ouse. Standart tam hücre kayıtları dilimleri nöronların yapılır ve ilgi bir ilaç ile dolu ikinci bir mikropipet kaydedilen hücrenin yakınında pozisyon içine manevra edilir. Ilaç ile dolu pipet içine basınçlı hava, nitrojen veya inert bir enjeksiyon kaydedilmiş hücrenin üzerine pipetle çıkartılabilmesi için ilaç solüsyon bir miktar neden olur. Bu yöntemi kullanarak, nAChR-aracılı akımları milisaniyelik doğrulukla çözülecek edebiliyoruz. İlaç uygulama zamanları kolayca değiştirilebilir ve uyuşturucu dolu bir pipet konsantrasyon-cevap eğrileri tek bir nöron için oluşturulmuş olması için izin veren yeni bir pipet yardımıyla çekilerek değiştirilebilir. NAChR nörobiyolojide bağlamında tarif olmasına rağmen, bu yöntem beyin kesitleri nöronları içinde ligand-kapılı iyon kanalları ya da reseptörleri birçok türleri çalışmak için yararlı olacaktır.
Bu çalışmada sunulan yöntem, beyin dilim hazırlıkları ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için geniş yararlıdır. Bununla birlikte, önemli ölçüde deneysel veriler, bu yöntemi kullanarak gelen nihai ürünün kalitesi ve yeniden üretilebilirlik etkileyecek bir dizi faktör vardır. Örneğin, uyarılmış akımları ilaç ile dolu bir pipet ucu çapına karşı çok duyarlıdır. Küçük ipuçları ilaç solüsyonu ve düşük direnç ile büyük ipuçları kaydedilen hücre ve kayıt elekt…
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe DA030396 tarafından desteklenmiştir. Yararlı tartışma ve yazının eleştirisi için Drenan laboratuar üyeleri sayesinde. Mi Özel sayesinde erişkin fare beyin dilimleri ile ilgili tavsiyeler için teknik yardım ve Jonathan Thomas Ting için Kim Ran.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 |
KCl | Sigma | P3911 |
NaH2PO4 | Sigma | S9638 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
HEPES | Sigma | H3375 |
glucose | Sigma | G5767 |
Na+ ascorbate | Sigma | A4034 |
thiourea | Sigma | T8656 |
Na+ pyruvate | Sigma | P2256 |
MgSO4•7H2O | Sigma | 230391 |
CaCl2•2H20 | Sigma | 223506 |
NaCl | Sigma | S9625 |
Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 |
potassium gluconate | Sigma | G4500 |
EGTA | Sigma | E3889 |
Mg-ATP | Sigma | A9187 |
GTP | Sigma | G8877 |
DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | |
P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | |
RC-27 Recording chamber | Warner | |
TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 |
SH-27B Solution heater | Warner | 640102 |
Nikon FN-1 | Nikon | |
C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | |
Picospritzer III | General Valve Co. | |
MP-285 Micromanipulator | Sutter | |
PA-100 Piezoelectric translator | piezosystem jena, Inc. | |
12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | |
Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | |
Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |