Summary

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Published: October 29, 2012
doi:

Summary

In diesem Papier beschreiben wir eine nützliche Methode, um Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Neuronen akut isolierten Hirnschnitten studieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Arzneimittels, gefüllte Mikropipette zur lokalen Anwendung von Medikamenten, um unter Verwendung von Standard aufgezeichnet Neuronen Patch-Clamp-Techniken.

Abstract

Tabakkonsum führt zu zahlreichen gesundheitlichen Problemen wie Krebs, Herzkrankheiten, Emphysem und Schlaganfall. Sucht nach Zigarettenrauchen ist eine weit verbreitete neuropsychiatrische Erkrankung, die von den biophysikalischen und zellulären Wirkungen von Nikotin auf Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren (nAChR) im gesamten zentralen Nervensystem beruht. Das Verständnis der verschiedenen nAChR Subtypen, in Hirnregionen, die für Nikotinsucht existiert ist eine wichtige Priorität.

Experimente, die Elektrophysiologie Techniken wie whole-cell Patch-Clamp-oder Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Aufnahmen verwenden, sind für die pharmakologische Charakterisierung von nAChRs von Interesse nützlich. Exprimieren nAChRs, wie Säuger Gewebekulturzellen oder Xenopus laevis Oozyten sind galvanisch getrennt und können daher leicht studiert mit den Mitteln der modernen Pharmakologie. Große Fortschritte wurden gemacht mit diesen Techniken, insbesondere wenn die Target-Rezeptor bereits bekannt wurdend ektopische Expression wurde problemlos erreicht. Oft ist es jedoch notwendig, um nAChRs in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren: in Neuronen innerhalb Hirnschnitten akut vom Labor Mäusen oder Ratten geerntet. Beispielsweise exprimieren mice "hypersensitiven" nAChR-Untereinheiten wie α4 L9'A Mäusen 1 und α6 L9'S Mäusen 2, zur eindeutigen Identifizierung der Neuronen auf ihre funktionelle Expression eines spezifischen nAChR-Untereinheit basierend ermöglichen. Obwohl whole-cell Patch Clamp Messungen von Neuronen in Hirnschnitten wird routinemäßig durch den Fachmann Elektrophysiologen getan, ist es eine Herausforderung vor Ort gelten Drogen wie Acetylcholin oder Nikotin auf die aufgezeichneten Zelle innerhalb eines Hirnschnitt. Verdünnung der Wirkstoffe in die Superfusat (Badapplikation) nicht schnell reversible und U-Rohr-Systeme sind nicht leicht angepasst, um mit Hirnschnitten arbeiten.

In diesem Papier beschreiben wir ein Verfahren zur schnellen Anwendung nAChR-aktivierende Medikamente Neuronen im erwachsenen m erfasstOuse Hirnschnitten. Standard Ganzzellableitungen aus Neuronen in Scheiben hergestellt, und ein zweites Mikropipette mit einem Medikament gefüllt ist von Interesse in Position in der Nähe der Zelle aufgenommen manövriert. Eine Injektion von Druckluft oder inerten Stickstoff in das Medikament gefüllten Pipette entsteht eine kleine Menge an Arzneimittel Lösung aus der Pipette auf die aufgezeichnete Zelle ausgestoßen werden. Mit dieser Methode sind nAChR-vermittelten Ströme können mit Millisekunden-Genauigkeit gelöst werden. Medikamentenapplikation mal leicht variiert werden, und das Arzneimittel gefüllten Pipette kann zurückgezogenen und mit einer neuen Pipette ersetzt werden, so dass für Konzentrations-Wirkungs-Kurven für ein einziges Neuron geschaffen werden. Obwohl im Rahmen der nAChR Neurobiologie beschrieben wurde, sollte diese Technik nützlich sein für die Untersuchung vieler Arten von Liganden-gesteuerte Ionenkanäle oder Rezeptoren im Gehirn Neuronen von Scheiben.

Protocol

Ein. Herstellung von Lösungen für Brain Scheibe Vorbereitung und Elektrophysiologie Lösungen für die Herstellung von Hirnschnitten wurden bisher 3, 4 beschrieben. Planen N-Methyl-D-glucamin (NMDG)-basierten Schneiden und Recovery-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mM): 93 N-Methyl-D-Glucamin, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 Glucose, 5 Na + Ascorbat, 2 Thioharnstoff, 3 Na + Pyruvat, 10 MgSO 4 • 7H 2…

Representative Results

In unseren Experimenten haben wir routinemäßig von Dopamin (DA)-produzierenden Neuronen des ventralen Tegmentum (VTA) und der Substantia nigra pars compacta (SNC) aufzuzeichnen. Im Spannungs-Clamp-Modus wird Druckbeaufschlagung von Acetylcholin oder Nikotin an diese Zellen typischerweise in einer schnellen, einwärts Kationenstrom die Spitze erreicht innerhalb von 100 bis 200 ms (Fig. 1A-B) führen. Abklingen des Stroms wird weitgehend durch die Diffusion des Arzneimittels aus dem Wirkort diktiert, un…

Discussion

Das Verfahren in diesem Papier ist weitgehend nützlich für die Untersuchung Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Hirnschnitt Vorbereitungen. Es gibt jedoch eine Reihe von Faktoren wesentlich beeinflussen die Qualität und Reproduzierbarkeit der experimentellen Daten, die sich aus der Verwendung dieser Methode. Beispielsweise sind hervorgerufene Ströme sehr empfindlich auf den Durchmesser der Spitze des Arzneimittels gefüllten Pipette. Kleine Tipps werden Schwierigkeiten mit Ausstoßen der Arzneimittellösung…

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) Gewährung DA030396 unterstützt. Dank an die Mitglieder des Drenan Labor für hilfreiche Diskussionen und Kritik des Manuskripts. Besonderer Dank geht an Mi Ran Kim für technische Hilfe und Jonathan Thomas Ting um Rat bezüglich erwachsenen Maus Hirnschnitten.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
N-Methyl D-glucamine Sigma M2004
KCl Sigma P3911
NaH2PO4 Sigma S9638
NaHCO3 Sigma S6014
HEPES Sigma H3375
glucose Sigma G5767
Na+ ascorbate Sigma A4034
thiourea Sigma T8656
Na+ pyruvate Sigma P2256
MgSO4•7H2O Sigma 230391
CaCl2•2H20 Sigma 223506
NaCl Sigma S9625
Na+ pentobarbital Vortech Pharmaceuticals 76351315
potassium gluconate Sigma G4500
EGTA Sigma E3889
Mg-ATP Sigma A9187
GTP Sigma G8877
DSK-Zero 1 Vibrating slicer Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming/Brown micropipette puller Sutter
RC-27 Recording chamber Warner
TC-344B Perfusion heater controller Warner 640101
SH-27B Solution heater Warner 640102
Nikon FN-1 Nikon
C-7500 CCD Video camera Hamamatsu
Picospritzer III General Valve Co.
MP-285 Micromanipulator Sutter
PA-100 Piezoelectric translator piezosystem jena, Inc.
12V40 piezo amplifier piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B Molecular Devices Corp.
Digidata 1440A Molecular Devices Corp.

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Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (68), e50034, doi:10.3791/50034 (2012).

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