Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS)
Summary
Cáncer de fibroblastos asociados (CAF) facilitar la iniciación del crecimiento del tumor y la progresión a través de señalización que promueve la proliferación, la angiogénesis y la inflamación. Aquí se describe un método para aislar poblaciones puras de los fibroblastos normales y CAFS de ratón fresco y tejidos humanos por clasificación de células, usando PDGFR como un marcador de superficie.
Abstract
Asociados con el cáncer fibroblastos (CAF) son el tipo celular más importante en el estroma tumoral de muchos tipos de cáncer, en particular, carcinoma de mama, y su presencia prominente menudo está asociada con mal pronóstico 1,2. CAFs son una subpoblación de fibroblastos estromales activados, muchas de las cuales expresan el marcador de miofibroblastos α-SMA 3. CAF se originan a partir de los fibroblastos del tejido local, así como de derivados de médula ósea células reclutadas en el tumor en desarrollo y adoptar un fenotipo CAF bajo la influencia del microambiente del tumor 4. CAF se muestra para facilitar la iniciación del crecimiento del tumor y la progresión a través de señalización que promueve la proliferación de células tumorales, angiogénesis, invasión y 5-8. Hemos demostrado que la CAF estimular el crecimiento tumoral mediante la mediación de tumor que promueven la inflamación, a partir de las primeras etapas de pre-neoplásicas 9. A pesar de la creciente evidencia de las CAF papel clave que desempeñar para facilitar el crecimiento del tumor,CAF estudian ha sido un reto en curso debido a la falta de marcadores específicos de CAF y la gran heterogeneidad de estas células, con muchos subtipos co-existentes en el microambiente tumoral 10. Además, el estudio de fibroblastos in vitro se ve obstaculizada por el hecho de que su perfil de expresión de genes a menudo se altera en cultivo de tejidos 11,12. Para abordar este problema y para permitir la expresión de genes de perfiles imparcial de fibroblastos de ratón fresco y tejidos humanos, hemos desarrollado un método basado en los protocolos anteriores para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) 13,14. Nuestro enfoque se basa en la utilización de PDGFR como un marcador de superficie para aislar fibroblastos de ratón fresco y el tejido humano. PDGFR se expresa abundantemente por ambos fibroblastos normales y cafés 9,15. Este método permite el aislamiento de poblaciones puras de fibroblastos normales y cafés, incluyendo, pero no limitado a α-SMA + activado miofibroblastos. Fibroblastos aislados pueden entonces serutilizado para la caracterización y la comparación de la evolución de la expresión génica que se produce en los CAF durante la tumorigénesis. De hecho, nosotros y otros informaron de perfiles de expresión de los fibroblastos aislados por clasificación celular 16. Este protocolo se realizó con éxito para aislar y crear un perfil poblaciones altamente enriquecidas de fibroblastos de tejidos de piel, páncreas mamaria, y pulmón. Además, este método también permite el cultivo de células clasificadas, con el fin de realizar los experimentos funcionales y para evitar la contaminación por las células tumorales, lo cual es a menudo un gran obstáculo cuando se trata de los CAF de cultivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mientras que los experimentos realizados en cultivo de tejidos puede ser informativo y sugieren principios funcionales que se pueden verificar in vivo, se sabe que ocurren grandes cambios en la expresión génica de las células en cultivo 11,12. Con el fin de evitar una etapa de cultivo de tejidos cuando el perfil de expresión de genes en fibroblastos, hemos desarrollado un protocolo que permite el aislamiento de normales, así como los asociados al cáncer de fibroblastos de ratón fresco o tejido…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Itzjak Oschry y el Dr. Orit Sagi-Asif, por su ayuda con la clasificación de FACS. Esta investigación fue apoyada por las subvenciones a NE del Programa Europeo sobre el Séptimo Programa Marco de la Unión (FP7/2007-2013) en el marco del acuerdo de subvención n º [276890], de la Asociación de Cáncer de Israel (# 20110078), y de la Israel Cancer Research Fund (Investigación Career Development Award).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth–bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 .
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
