Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)
Summary
Cancer Associated Fibroblasten (CAF) te vergemakkelijken tumorinitiatie, groei en progressie door te geven dat bevordert de proliferatie, angiogenese en ontsteking. Hier beschrijven we een methode om pure populaties van normale fibroblasten en CAF isoleren van verse muis en humane weefsels door celsortering, met PDGFRα als oppervlaktemerker.
Abstract
Kankergeassocieerde fibroblasten (CAF) zijn de voornaamste celtype in de tumorstroma van vele soorten kanker, in het bijzonder borstkanker, en de prominente aanwezigheid wordt vaak geassocieerd met een slechte prognose 1,2. CAF zijn een geactiveerd subpopulatie stromale fibroblasten, waarvan vele drukken de myofibroblast marker α-SMA 3. CAF afkomstig zijn van plaatselijke weefsel fibroblasten en van beenmerg afgeleide cellen gerekruteerd voor de ontwikkeling en tumor CAF fenotype onder invloed van de tumor micro 4 nemen. CAF werd aangetoond dat de tumor initiatie, groei en vooruitgang te bevorderen door middel van signalering dat bevordert tumorcelproliferatie, angiogenese en invasie 5-8. We hebben aangetoond dat CAF tumor groei door bemiddeling tumor-bevorderende ontsteking, vanaf de eerste stadia preneoplastisch 9. Ondanks de toenemende bewijs van de belangrijke rol CAF spelen in het faciliteren van de groei van tumoren,bestuderen CAF is een permanente uitdaging vanwege het ontbreken van CAF-specifieke markers en de enorme heterogeniteit van deze cellen met vele subtypen coëxisterende in de tumor micro-omgeving 10. Bovendien onderzoekt fibroblasten in vitro belemmerd door het feit dat hun genexpressieprofiel vaak veranderd in weefselkweek 11,12. Om dit probleem aan te pakken en onpartijdige genexpressie van fibroblasten van verse muis en menselijke weefsels mogelijk te maken, werd een methode ontwikkeld op basis van eerdere protocollen voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 13,14. Onze aanpak is gebaseerd op het benutten van PDGFRα als een oppervlak marker om fibroblasten te isoleren van verse muis en menselijk weefsel. PDGFRα is overvloedig uitgedrukt door zowel de normale fibroblasten en CAF 9,15. Deze methode maakt isolatie van zuivere populaties van normale fibroblasten en CAF, inclusief maar niet beperkt tot α-SMA + geactiveerd myofibroblasten. Fibroblasten geïsoleerd kunnen danvoor karakterisering en vergelijking van de ontwikkeling van genexpressie die optreedt in CAF tijdens tumorigenese. Sterker nog, wij en anderen gemeld expressie profilering van fibroblasten geïsoleerd door celsortering 16. Dit protocol werd met succes uitgevoerd te isoleren en hoogverrijkt populaties van fibroblasten profiel van de huid, borstklier, pancreas en longen. Bovendien maakt onze methode ook kweken van cellen gesorteerd, om functionele experimenten en verontreiniging door tumorcellen, die vaak een groot obstakel wanneer het proberen om cultuur CAF voorkomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl experimenten uitgevoerd in weefselkweek kan informatief en suggereren functionele principes die kunnen worden geverifieerd in vivo is bekend dat grote veranderingen in genexpressie van cellen in kweek 11,12. Om een weefselkweek stap vermijden wanneer genexpressie profilering in fibroblasten, ontwikkelden we een protocol waarmee Isolatie van normale, evenals kanker geassocieerde fibroblasten van verse muis of menselijk weefsel. Dit protocol werd met succes toegepast met de huid, pancreas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Jitschak Oschry en Dr Orit Sagi-Asif voor hun hulp bij FACS sortering. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies aan NE van de Europese Unie zevende kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst nr. [276890], van het Israël Cancer Association (# 20110078), en van de Israëlische Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth–bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 .
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
