Мы разработали анализ слияния клеток, который количественно SNARE-опосредованных событий слияние мембран активированным выражение β-галактозидазы.
Взаимодействий SNARE (ы oluble N-этилмалеимид-чувствительных факторов повторного ttachment белком рецептор) белков на пузырьках (V-SNAREs) и на цели мембран (т-SNAREs) катализирует внутриклеточные везикулы слияния 1-4. Восстановление анализы имеют важное значение для рассечения механизмов и регуляции обмена SNARE-опосредованного слияния мембран 5. В анализе слияния клеток 6,7, Малый белки экспрессируются эктопически на поверхности клетки. Эти "перевернул" SNARE белков диск клетка-клетка слияния, демонстрируя, что SNAREs достаточно, чтобы слиться клеточных мембран. Поскольку анализ слияния клеток основана на микроскопическом анализе, он менее эффективен, когда используется для анализа нескольких В-и Т-SNARE взаимодействия количественно.
Здесь мы описываем новую анализа 8, что количественно SNARE-опосредованных событий слияния клеток активированными выражение β-галактозидазы. ДваКомпоненты Tet-Off экспрессии генов системы 9 используются в качестве считывания системы: тетрациклин-контролируемой трансактиватор (TTA) и репортера плазмиды, который кодирует ген LacZ под контролем тетрациклин-ответ элемент (TRE-LacZ). Мы трансфекции TTA в COS-7 клетки, которые экспрессируют перевернутый V-SNARE белков на поверхности клетки (В-клетки) и трансфекции TRE-LacZ в COS-7 клетки, которые экспрессируют перевернулся T-SNARE белков на поверхности клетки (Т-клетки) . SNARE-зависимых слияние В-и Т-клеток приводит к связыванию TTA, чтобы TRE, транскрипционной активации LacZ и экспрессии β-галактозидазы. Активность β-галактозидазы количественно использованием колориметрическим методом по поглощению при 420 нм.
Пузырька связанных мембранных белков (вампиры) являются V-SNAREs, которые находятся в различных пост-Гольджи везикулярного отсеков 10-15. Выражая 1 вампиров, 3, 4, 5, 7 и 8 на том же уровне, мы сравниваем их слияние мембрандеятельности с использованием ферментативного анализа слияния клеток. На основании спектрометрических измерений этого анализа предлагается количественный подход к анализу SNARE-опосредованного слияния мембран и высокой пропускной исследований.
Оригинальный анализ слияния клеток 6 определяет SNARE-опосредованных событий слияние клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь мы опишем инновационного анализа, который количественно SNARE-опосредованных событий слияния клеток активированными выражение β-галактозидазы и…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа поддерживается запуск средств из Университета Луисвилл и CA135123 из Национальных институтов здравоохранения (CH).
Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
pTet-Off | Clontech | K1620-A |
pBI-G | Clontech | 6150-1 |
lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |