We hebben een celfusie test die SNARE-gemedieerde membraanfusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase.
De interacties van SNARE (s oluble N-ethylmaleimide-gevoelige factor een ttachment eiwit re Ceptor) eiwitten op blaasjes (v-snaren) en op doel membranen (t-snaren) katalyseren intracellulaire vesikels fusie 1-4. Reconstitutie testen zijn essentieel voor het ontleden van het mechanisme en de regeling van SNARE-gemedieerde membraanfusie 5. In een celfusie assay 6,7 worden SNARE eiwitten ectopisch tot expressie op het celoppervlak. Deze "omgedraaid" SNARE eiwitten schijf cel-cel fusie waaruit blijkt dat SNAREs volstaan om celmembranen fuseren. Omdat de celfusie test is gebaseerd op microscopische analyse is minder efficiënt bij gebruik van meerdere v-en t-SNARE interacties kwantitatief te analyseren.
Hier beschrijven we een nieuwe assay 8 dat SNARE gemedieerde fusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase. Tweecomponenten van het Tet-Off genexpressiesysteem 9 gebruikt als uitleessysteem: de tetracycline-gecontroleerde transactivator (tTA) en een reporter plasmide dat het LacZ gen onder controle van de tetracycline-response element (TRE-LacZ) codeert. We transfecteren tTA in COS-7 cellen die v-SNARE eiwitten op het celoppervlak (v-cellen) en transfecteren TRE-LacZ gedraaid in COS-7 cellen die t-SNARE eiwitten omgedraaid op het celoppervlak (T-cellen) . SNARE-afhankelijke fusie van het v-en T-cellen resulteert in de binding van tTA met TRE de transcriptie-activering van LacZ en expressie van β-galactosidase. De activiteit van β-galactosidase wordt gekwantificeerd met een colorimetrische methode absorptie bij 420 nm.
De blaasjes-geassocieerde membraaneiwitten (vamps) zijn v-SNAREs die zich in verschillende post-Golgi vesiculaire compartimenten 10-15. Uitspreken vamps 1, 3, 4, 5, 7 en 8 op hetzelfde niveau vergelijken we de membraanfusieactiviteiten met de enzymatische assay celfusie. Op basis van spectrometrische meting, deze test biedt een kwantitatieve benadering voor het analyseren van SNARE-gemedieerde membraanfusie en voor high-throughput studies.
De oorspronkelijke celfusie assay 6 bepaalt SNARE gemedieerde fusie events met fluorescentiemicroscopie. Hier beschrijven we een innovatieve assay die SNARE gemedieerde fusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase en spectrometrische metingen. Met deze assay, we routinematig analyseren 15-20 v-en t-SNARE combinaties in een experiment. Met behulp van flowcytometrie om SNARE expressie te meten op het celoppervlak, we titreren de expressie niveaus van vamps en vergelijken hun membr…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door het opstarten fondsen van de Universiteit van Louisville en CA135123 van de National Institutes of Health (tot CH).
Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
pTet-Off | Clontech | K1620-A |
pBI-G | Clontech | 6150-1 |
lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |