1. Cilt Diseksiyon için 0 ila 2 gün Eski Yenidoğan Fare hazırlayın En az 20 dakika süreyle bir CO 2 odalarını kullanarak fare yavrular Euthanize. Kadar diseksiyonu kadar bir saat için buz üzerinde yavrular bırakın. P0-P2 fareler oldukça eski fareden hazırlanan hücreler olarak tavsiye edilir progenitör kapasitesi düşmüş düşük greft verimleri sonuçlar. % 70 etanol bir tabak (adım 1.3) ve yıkama solüsyonu üç yemekler (adım 3) hazırlayın cildin diseksiyon yapmaya hazır. Dispase Çözüm çözülme ve 4 bırakın ° C Servikal ötanazi sağlamak için CO 2 aşırı maruz kalma sonrasında yavruların yerinden. Buz ve steril bir akış kaputu transferi bir kültür çanak ötenazi yavrular yerleştirin. Kısaca steril kültür çanağı üzerine% 70 etanol ve yerde daldırarak yavrular yıkayın. 2. Fare Cilt teşrih Steril makas ile gövde tabanına her uzuv ve kuyruk kesiniz. Cu çifti arasında sıkıca vücut tutunSVEd forseps ve baş yatan fasya nüfuz etmeden bir neşter kullanılarak kuyruk dorsal cilt boyunca bir kesi yapmak. Dikkatlice uzakta fare orta hattan cilt soyma. Kavisli bir forseps uzun kenarı ile sıkıca maruz fare tutun ve fare posterior sonunda deri altında kavisli bir forseps bir çift ekleyin ve hafifçe fare ventral yarısında doğru kalça üzerine deri çekin. Dikkatle tek bir hareketle tamamen fare kapalı cilt soyma ve karkas atın. 3. Dispase Çözüm Cilt ve İnkübasyon yıkayın Dermis yüzü yıkama solüsyonunun ilk çanak cildin aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Cilt Dağılın ve forseps ile karıştırılır. Sonraki kaplamayı diseksiyon ise yıkama solüsyonunun ilk çanak cilt bırakın. Yıkama çözeltisinde ilk çanak içinde bir sonraki parçalara deri yerleştirdikten sonra, yıkama çözeltisi, ikinci çanak için önce deri aktarın. Inci derileri tutune ikinci yıkama solüsyonu bütün derilerden toplanana kadar. Nihai yıkama derileri tüm transfer, kısaca ajitasyon. Steril bir 10 cm kültür çanak için 10 ml buz soğuk dispase ekleyin. Dispase Çözüm için cilt aktarın ve cilt Dermis tarafı aşağı dümdüz. 4 de 8-16 saat boyunca cildi Float ° C (alternatif seçenek: 1 saat 37 ° C'de). 4. Ayrı Dermis ve epidermis Yeni bir steril kültür çanak için cilt aktarın ve cilt Dermis tarafı aşağı dümdüz. Bir neşteri ile bir köşeden dermis dikkatlice basılı tutun. Forseps ile epidermis kavrayın ve yavaşça sıyırın dermis. Epidermis uzakta tek parça olarak soyma gerekir. Epidermis beyaz ve ince olacak ve dermis, kahverengimsi kalın ve jelatinimsi olmalıdır. Ayrı steril kültür kaplarına iki dokular ayırın. Bir dermal özgü gen demonte / aşırı greft yapmak için, dermis almak ve t ile çok küçük parçalar halinde doğrayınwo neşter. Epidermis atın. Enfeksiyonu (adım 7) günü, lentiviral enfekte cilt hücreleri birleştirmek için taze, işlenmemiş epidermal hücreler hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih. Epidermal özgü gen demonte / aşırı greft yapmak için, 6 içine her epidermisin dilim – 8 küçük parçalar. Dermis atın. Enfeksiyonu (adım 7) günü, lentiviral enfekte epidermal hücreleri ile birleştirmek için taze, işlenmemiş deri hücrelerini hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih. 5. Kıyılmış Doku Primer Fare Dermal Hücreleri (MDCS) ayrışır 1 saat boyunca 37 ° C 'de taze collagenase Çözelti, dermal parçalar inkübe edilerek MDCS ayrışır. Yavru fare başına kollajenaz Çözüm 10 ml kullanın. Yavaşça solüsyon içeren dermis her 10 dk karıştırın. Bir mikroskop altında ayrışma derecesini kontrol edin; sindirilmiş hücre süspansiyonu çoğunlukla tek hücre olmalıdır. Çözüm açık itibaren bulutlu değiştirmek gerekirdermal hücrelerin dermis uzaklaşılmış. Kollajenaz aktivitesini azaltmak için% 10 nihai hacmi dermis içeren Kollajenaz Çözüm FBS ekleyin. Sindirilmemiş iri küme ve bütün köklerinin kaldırmak için yeni bir 50 ml tüp içine bir 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirir. 30 ml başına DMEM/10% FBS 10 ml ekleyin akan daha kollajenaz sulandırmak için. Santrifüj tüpleri daha bütün köklerinin kaldırmak için 5 dakika süreyle bir masa santrifüj 30 xg'de sindirilmiş dermis içeren. Yeni bir 50 ml tüp süpernatantı dikkatle aktarın. 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg'de santrifüj Pelet hücreleri. DMEM/10% FBS ile hücrelerin (yavru başına 1 ml) süspanse edin ve hücreleri saymak. Enfeksiyonu için Amniomax C-100 medya (adım 7) Levha hücreleri veya (adım 9) greft lentivirüs-enfekte KC ile birleştirmek. Tipik verim yavru başına 20 x 10 6 hücre olduğunu. 6. Birincil Keratinosit çözerlerKıyılmış Doku dan s (KC) 15 dakika boyunca 37 ° C 'de taze çözülmüş% 0.05 tripsin-EDTA ile epidermal parçalar inkübe edilerek KC ayrışır. Pup fare başına Tripsin-EDTA 7 ml kullanımı. Epidermis her 5 dk içeren yavaşça girdap çözüm. Tripsin aktivitesini azaltmak için tripsin-EDTA içeren epidermis Nötralleştirme Çözüm eşit hacmi ekleyin. 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg'de santrifüj Pelet hücreleri. Kalan sindirilmemiş dokusu üstünde yüzer olmalıdır. Dikkatlice sindirilmemiş doku ile süpernatant çoğu kapalı dökün. Rahatsız edici hücre pelletini olmadan bir 10 ml pipet ile kalan Süpernatantı. PBS ile hücre pelletini tekrar. Durumda KCS tamamen pelet değil, süpernatant çoğu kapalı dökün ve en hücrelerin peletlenmiş kadar santrifüj tekrarlayın. Kalan doku veya kümeleri kaldırmak için yeni bir tüpe 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu süzün. Santrifüj Pelet hücreleri5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg. CnT-07 ortamı ya da PBS (PUP başına 1 ml) ve sayım hücrelerde yeniden süspanse hücreler. Enfeksiyonu için kaplama hücreleri (adım 7) CnT-07 kullanın (adım 9) greft lentivirüs-enfekte MDCS ile birleştirmek PBS kullanın. Tipik verim yavru başına 3-10 x 10 6 hücre olduğunu. 7. ShRNA veya cDNA içerenler Lentivirus ile Primer Hücre Infect Enfeksiyon gününde (adım 9) aşılama günü virüsle enfekte olan hücreleri birleştirmek için taze, işlenmemiş primer KCS veya MDCS hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih. MDCS için plaka 4 x 10 37 AmnioMAX-C100 medya ve inkübe ile 10-cm plaka başına 6 MDCS ° C,% 50 hücre yoğunluğu ertesi gün enfeksiyon için +% 5 CO 2. MDCS genellikle 3-4 plakaları bir aşı üretmek için kullanılır, ve plakalar 10-12 toplam bir deneyde, üç greft üretmek için ihtiyaç vardır. Alternatif olarak, MDCS eklemek izin ve f yayıldıya da 37 az 2 saat, en az ° C ±% 5 CO2 ve enfeksiyon hücre kaplama aynı gün yerine getirir. MDCS fibroblast benzeri morfolojiye sahip olacaktır. KC için, plaka 12 x 10 37 CnT-07 medya ve inkübe ile 10-cm plaka başına 6 KC ° C ertesi gün enfeksiyon için +% 5 CO 2. Alternatif olarak, KC 37 az 2 saat en az takın ve yaymak izin ° C +% 5 CO 2 ve aynı gün enfeksiyonu gerçekleştirin. KC Genellikle 3-4 tabak bir greft oluşturmak için kullanılır. 10-12 plakaları toplam bir deney için üç greft üretmek için ihtiyaç vardır. KCS arnavut morfolojisi sahip olacaktır. 37, 8 ug / ml Polybrene Çözelti ° C ±% 5 CO2 ile 5-10 dakika için hücreler Preincubate. Değişim medya ve lentivirüs eklemek + 8 mg / ml Polybrene Çözüm. Lentiviral titresi inşa kullanılan ve enfeksiyon öncesi tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir. 32, 1 saat boyunca bir masa üstü santrifüjü 200 x g'de santrifüjleyin ° plakaları; Lentivirüs ile hücreleri enfekte etme C. Lentivirüs içeren ortamları çıkarın ve taze medya ekleyin. KC için, taze medya geri eklemeden önce bir kez PBS ile hücreleri yıkayın. Genellikle enfekte hücreleri kurtarmak 37 gecede ° C +% 5 CO 2. Alternatif olarak, 37 iyileşme en az iki saat izin ° C aşı için hücreler tripsinize önce +% 5 CO2. Temsilcisi Sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi enfeksiyon verimliliğini kontrol etmek için kültür bulaşmış hücrelerin küçük bir kısmı için devam edin. 8. Aşılama için Enfekte Hücreler hazırlayın 4-6 arasındaki adımları kullanarak cilt taze primer MDCS veya KCS ayırın. Buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Hücreleri saymak. Dermal spesifik gen devirme / ekspresyonu için aşı, 8 dk için 37 ° C sıcaklıkta% 0.05 tripsin-EDTA ile plakalar enfekte MDCS ayrışır. Epidermal özgü gen demonte / aşırı greft için plakalar USI enfekte KC ayırmak37 ng% 0.125 Tripsin-EDTA ° C de 15 dakika. DMEM +% 10 FBS (MDCS) veya Nötralleştirme Çözüm (KC) kullanarak tripsin aktivitesini nötralize. 50 ml'lik bir tüpe hücreler tripsinize aktarın. 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg'de santrifüj Pelet hücreleri. Buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Hücreleri saymak. Taze hazırlanmış işlenmemiş mevkidaşı ile hücre tipi virüsle enfekte olan hücreleri birleştirin. Bir greft için, 4 ° C'de buz soğuk steril PBS ve pelet bir masaüstü santrifüj hücre bulamaç 7-10 x 10 6 KCS ile 7-10 x 10 6 MDCS birleştirmek 50 -100 ul buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Nu / nu fare odaları hazır olana kadar buz üzerinde hücreleri tutun. 9. Nu / nu Fare Back üzerine Yara Yatak ve Fix Odası Oluştur Greftleme bir gün önce% 70 etanol içinde iliklerine tarafından otoklav ve steril silikon odaları ile cerrahi aletleri sterilize edin. 70% etha değiştirinodaları kullanmadan önce steril PBS ile nol. Anestetize nu / nu fare (7-12 haftalık dişi) intraperitoneal (100 μl/10 g vücut ağırlığı) ya da başka bir tercih edilen yöntemi yolu ile ketamin (8 mg / ml) / ksilazin (1.6 mg / ml) kullanarak. Göz yağlayıcı. Farenin altındaki Sıra ısıtma pedi. Iyot ile çıplak fare geri deriyi dezenfekte ve alkol bezlerden ile temizleyin. 1-3 topikal kesi site% 0.25 bupivakain düşer ekleyin. Forseps ile boyun tabanındaki çıplak fare geri cilt sıkıştırın. Steril makasla sıkışmak deride küçük dairesel delik (çapı ~ 1 cm) kesin. Yara yatağı üzerine steril odasına yerleştirin ve cilt çevreleyen odaya kenarlarını kaplayacak. Şekil 2A gösterildiği gibi kamara kenarlarında dikiş (kamara başına 6 dikiş) ile yerine Güvenli odası. odaları hazır, yavaşça girdap hücre çamur ve 1 ml enjektöre bağlanmış 23 gauge iğne içine çekmek. Hücre bulamaç yavaşça alt yoğunlaşmış iseiğne içine çizmeden önce 1 ml pipet ucu ile tekrar süspansiyon haline getirin. Delinme iğne ile oda ve yavaş yara üzerine hücreleri damla. Temiz, otoklavlanmış kafesleri içine yerleştirin fareler. House 2 kafes başına fareler ve içme suyu için antibiyotik ve Tylenol (3 mg / ml) ekleyin. Bizim tecrübelerimize göre, kafes başına iki dişi farelerde olumsuz odasına travma, greft, veya hayvan sağlamamıştır. Yarım kafesinin altında ısınma pedi yerleştirin ve anestezi kapalı giyer kadar fareler gözlemlemek. 10. 7-9 gün sonra Odası kaldır Adım 9.1 'de olduğu gibi odacıklı nu / nu fare anestetize. Göz yağlayıcı. Iyot odasının etrafında deriyi dezenfekte ve alkol bezlerden ile temizleyin. Dikkatlice dikiş kesip odasından çıkarın. Yavaşça fare odası çıkarın. Odaya yeni deri grefti sopa, forseps kullanarak odasından odasının parçası ve yavaşça ayrı greft kaldırırsanız. Odanın çıkarılması sırasında greft basılı tutun. Greft loo gerekirŞekil 2B gibi k mat ve opak. Yeri (2 ilmek) içine açık yara ve dikiş üzerine antibiyotik ince bir film ile bir yapışmaz pad uygulayın. Ped güvenli ve yara korumak için fare etrafında bandaj sarın. Yerine bandaj dikin. Silikon odaları sabunla ovarak temizlenmeli ve iyice deiyonize su ile durulanır. % 70 gecede etanol, hava kuru ve mağaza odaları bekletin. 11. Saç Büyüme için Fare inceleyin Odasının kaldırılması 3 gün sonra bandaj ve pedi çıkarın. Greft kuru ve kahverengi renkte opak olmalıdır. Saç büyümesi için periyodik farelerde kontrol edin. Saç greft sonra 16 gün de göstermeye başlamalıdır. Prosedür Anahat 1. Gün (2-3 saat): yenidoğan yavrular Kurban deri kaldırmak ve 4 ° C gecede dispase üzerine bırakın. 2. Gün (2-3 saat): derinin primer hücreler izole veönerilen hücre yoğunluğu plaka. 3. Gün (3-4 saat): lentivirüs sahip hücreler Infect. Yenidoğan yavruların başka bir dizi deri çıkarın ve 4 ° C gecede dispase üzerine bırakın. 4. Gün (6-8 saat): derinin primer hücreler izole, saymak ve buz üzerinde bırakın. Tripsinizasyonla ve santrifüj ile lentivirüs-enfekte hücreleri Kurtar, saymak ve greft başına PBS 50-100 ul içine 7-10 x 10 6 dermal hücrelerin ve keratinositlerin birleştirir. Fare üzerindeki yara yatağı oluşturma, kamara takın ve yatak yara hücre karışımı uygulanır. Alternatif Prosedürü Outlines Alternatif yordamı anahatları dört gün üç prosedürü kısaltacaktır. Bir saat (tahmini süre 5-7 saat) için 37 ° C'de dispase fare derileri davranarak Gün 1 ve Gün 2 birleştirin. İki saat boyunca kaplama hücreleri (tahmini süre 5-7 saat) sonra lentivirüs ile hücreleri nüfuz ederek Gün 2 ve 3. Gün birleştirin.