组织特异性分析的毛囊再生模型,利用慢病毒介导增益或损失的功能。
毛囊形态发生是一个复杂的过程,需要上皮细胞衍生的角质形成细胞和底层的间充质细胞之间的相互作用,是一个有吸引力的模型系统来研究器官发育和组织特异性的信号。虽然毛囊的发展是听话的基因,快速,重现性的分析,这个过程中的重要因素仍然是一个挑战。在这里,我们描述一个过程来产生有针对性的过表达或短发夹环介导的击倒的因素,使用慢病毒中的组织特异性的方式。使用修改后的版本毛发再生模型5,6,11,我们可以实现强大的增益或损失的小鼠原代角质细胞或皮肤细胞的功能分析,以方便上皮-间质的信号转导途径,导致毛囊形态发生的研究。我们描述了如何隔离新鲜小鼠角质形成细胞和真皮细胞,它含有毛乳头细胞和它们的前体,提供慢病毒含有宁shRNA或cDNA的一个细胞种群,细胞结合起来,以产生完全形成的裸小鼠的背部上的毛囊。这种方法允许需要在三个星期内产生毛囊组织的具体因素分析,现有的遗传模型提供了一个方便快捷的同伴。
头发重建试验研究的从头毛囊形成的机制提供了一个独特的器官再生模型。在这里,我们描述了修改后的腔头发检测,可用于确定毛囊形成的基因的功能。我们的测定是基于报告室头发重建测定5星,6,11,这是我们修改引入慢病毒的表达技术来实现的真皮或表皮细胞类型的基因过表达或击倒在。我们的分析提供了一个快速的替代品产生组织特异性基因敲除。此法使我们能够在短短的三个星期内,用慢病毒感染原代细胞移植收集在毛囊形成的基因功能演示。我们的检测可扩展,以解决使用组合短发夹/慢病毒的cDNA交付到一个单元格12型的遗传相互作用,以及允许信令之间的真皮和表皮细胞典型的检查ES。
我们的头发测定是最适合于检测强的增益或损失的函数在毛囊再生的表型,而微妙的缺陷是难以观察到。我们已经成功地证明的几个基因,用我们的头发再生实验1,12的真皮特定基因的功能。基于GFP标记的共表达的慢病毒载体shRNA表达10,我们表明,再生的毛发移植供体皮肤细胞的shRNA表达坚持。 GFP阳性细胞中存在的( 图3)的再生毛囊真皮乳头(DP)。 DP细胞可能包括不同程度的基因敲除细胞不同程度的GFP表达,从而观察到毛囊型范围从遗传hypomorph,为空。
此法的改进之一将是建立一个快速和有效的选择的shRNA表达细胞前graftin克如使用流式细胞仪,净化强烈的绿色荧光蛋白表达细胞。另一种方法是在此试验中9替代突变或条件性敲除细胞。另一方面,培养系统,可以保留DP细胞的功能是非常有用的,作为DP一旦主真皮细胞传代,逐渐失去效力。潜在的文化系统,包括使用生物材料来自人工的利基或聚集文化2,7,8,13。另一项改进将是产生一个可靠的表皮细胞的冷冻法具有高细胞的回收率,因为这将减少使用鼠标幼仔(步骤7)的第二组以产生新鲜的角质形成细胞,在真皮特定的损耗或增益功能的研究。
该室头发分析产生类似正常小鼠皮肤毛囊的密度和质量,但头发的生长是略低于同步和卵泡定位更随机。有一些限制的头发再生的基因检测含e是需要大量的慢病毒和细胞的数量,这是非常劳力密集的手术方法相比,其他形式的头发重建试验,如补丁和襟翼检测3,4,14。然而,毛囊和时间表的质量检测头发的生长优于其他实验4。我们的目标毛发再生现有的遗传模型分析提供了一个方便快捷的同伴。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由美国国立卫生研究院NRSA 1F32CA14208701(SXA)和国立卫生研究院资助AR052785 AR046786(AEO和W-MW)的支持。
Name | Company | Catalog # | Comments |
PBS | Invitrogen | 14190-144 | |
HBSS | Invitrogen | 14170-122 | |
DMEM | Invitrogen | 11995-065 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
Cnt-07 | Cell N Tec | CnT-07 | |
AminoMAX-C100 | Invitrogen | 17001-074 | |
AminoMAX-C100 Supplement | Invitrogen | 12556-015 | |
FBS | Invitrogen | 26140-079 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
Gentamycin | Invitrogen | 15710-064 | |
Dispase | Roche | 4942078001 | |
Collagenase, Type 1 | Sigma | C-0130 | |
Polybrene | Sigma | 107689-10G | |
Tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 11-999 | |
Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | curved |
Scalpal | Medex Supply | GRF-2975#10 | Size no. 10 |
70 μm cell stainer | VWR | 21008-952 | |
15 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
Alcohol swabs | Fisher Scientific | 1368063 | |
23 gauge needle | Fisher Scientific | 14-821-13F | |
Eye lubricant | CVS | 8883660 | |
Providone-lodine swabs | Fisher Scientific | NC0116841 | |
Silicon Chambers | Renner GmbH | F2U, 30268 | |
Sutures | Acuderm | SUP3524 | |
Flexible bandage | Fisher Scientific | 22-363-100 | |
Non-adherent dressing | TELFA | 1050 | |
Materials | |||
Wash solution PBS Dispase solution HBSS Neutralizing media HBSS Collagenase solution 0.25% (w/v) Collagenase, Type 1 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin 2.5 μg/ml Fungizone 50 μg/ml Gentamycin Polybrene solution HBSS |