Descriviamo l'isolamento rapido di primarie murine di tipo II le cellule epiteliali alveolari (AECII) per selezione di citometria di flusso negativo. Questi AECII mostrano alta vitalità e purezza e sono adatte per una vasta gamma di studi funzionali e molecolari riguardanti il loro ruolo in condizioni respiratorie come le malattie autoimmuni o infettive.
Durante gli ultimi anni, il contributo delle cellule alveolari di tipo II epiteliali (AECII) a vari aspetti della regolazione immunitaria nel polmone è stato sempre più riconosciuto. AECII hanno dimostrato di partecipare alla produzione di citochine in vie aeree infiammate ed agire anche come cellule presentanti l'antigene sia infezione e cellule T mediata autoimmunità 1-8. Pertanto, essi sono particolarmente interessanti anche in contesti clinici, quali vie aeree iper-reattività estera e di auto-antigeni così come le infezioni che direttamente o indirettamente si rivolgono AECII. Tuttavia, la nostra comprensione delle funzioni immunologiche dettagliate serviti da cellule alveolari di tipo II epiteliali nel polmone sano così come in infiammazione rimane frammentario. Molti studi in materia di funzione AECII vengono eseguite utilizzando il mouse o umani linee cellulari epiteliali alveolari 9-12. Lavorando con linee cellulari offre sicuramente una serie di vantaggi, come la disponibilità di grandi numeri of cellule per analisi approfondite. Tuttavia, riteniamo che l'uso di primaria AECII murino permette una migliore comprensione del ruolo di questo tipo di cellule in processi complessi come infezione o infiammazione autoimmune. Primaria AECII murino possono essere isolati direttamente da animali affetti da tali disturbi respiratori, nel senso che sono stati sottoposti a tutti gli altri fattori estrinseci che giocano un ruolo nel contesto analizzato. Come esempio, AECII vitali possono essere isolate da topi infettati intranasale con virus influenzale A, che colpisce principalmente queste cellule per la replicazione 13. È importante sottolineare che, attraverso l'infezione ex vivo di AECII isolati da topi sani, gli studi sulle risposte cellulari montati su di infezione può essere ulteriormente estesa.
Nostro protocollo per l'isolamento di primaria AECII murino si basa sulla digestione enzimatica del polmone topo seguita da etichettare la sospensione cellulare risultante con anticorpi specifici per CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 e CD16/CD32. AECII granulari vengono identificate come la dispersione non marcato e lateralmente alta (SSC alta) popolazione cellulare e sono separati da fluorescenza activated cell smistamento 3.
In confronto ai metodi alternativi di isolare cellule epiteliali primarie da polmoni di topo, il nostro protocollo per l'isolamento di citometria a flusso AECII per selezione negativa produce intatta, altamente puro AECII vitale e in tempi relativamente brevi. Inoltre, e in contrasto con i metodi convenzionali di isolamento di panning e deplezione dei linfociti tramite legame di anticorpo-accoppiati biglie magnetiche 14, 15, citometria a flusso di cellule ordinamento consente discriminazione attraverso dimensione cellulare e granularità. Dato che la strumentazione per selezione cellulare citofluorimetrica è disponibile, la procedura descritta può essere applicata a costi relativamente bassi. Accanto a anticorpi standard e enzimi per la disintegrazione del polmone, senza reagenti aggiuntivi, come magneticoperline sono richiesti. Le cellule isolate sono adatti per un'ampia gamma di studi funzionali e molecolari, che comprendono la coltura in vitro di cellule T e saggi di stimolazione così come trascrittoma, proteoma o analisi secretoma 3, 4.
Nostro protocollo per l'isolamento di AECII murino mediante citometria a flusso offre un modo rapido di accedere cellule primarie del polmone mouse per tutta una serie di studi funzionali e molecolari. La procedura descritta produce popolazioni altamente vitali e puro di AECII che sono in numero sufficiente per le successive analisi dirette, come l'RNA isolamento (vedi figura 2b) e studi del trascrittoma. Per applicazioni funzionali, è anche possibile per coltivare le cellule isolate, consenten…
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare M. Höxter per l'assistenza tecnica di ordinamento primario AECII murino dal livello di biosicurezza 2 campioni.
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione per la ricerca tedesca (DFG) a DB (SFB587, TP B12 e BR2221/1-1) e una borsa di studio dalla Scuola di Ricerca Biomedica di Hannover (DFG GSC 108) a AA. DB è supportato da Initiative del Presidente e del Fondo di rete dell'Associazione Helmholtz del tedesco Centri di Ricerca (HGF) con W2/W3-029 numero del contratto.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |