Isolation par cytométrie en flux des cellules primaires murins épithéliales alvéolaires de type II pour les études fonctionnelles et moléculaires
Summary
Nous décrivons l'isolement rapide des primaires murins cellules alvéolaires de type II épithéliales (AECII) par flux cytométrique sélection négative. Ceux-ci montrent AECII viabilité et à la pureté et conviennent à un large éventail d'études fonctionnelles et moléculaires concernant leur rôle dans les affections respiratoires comme les maladies auto-immunes ou infectieuses.
Abstract
Au cours des dernières années, la contribution des cellules alvéolaires de type II épithéliales (AECII) à divers aspects de la régulation du système immunitaire dans le poumon a été de plus en plus reconnue. AECII Il a été démontré à participer à la production de cytokines dans les voies respiratoires enflammées et même agir comme cellules présentatrices d'antigène à la fois l'infection et des lymphocytes T auto-immunité médiée par 1-8. Par conséquent, ils sont particulièrement intéressants dans les contextes cliniques tels que l'hyper-réactivité des voies aériennes à l'étranger et des auto-antigènes ainsi que les infections qui ciblent directement ou indirectement AECII. Cependant, notre compréhension des fonctions immunologiques détaillées desservis par les cellules alvéolaires de type II épithéliales des poumons en bonne santé ainsi que dans l'inflammation reste fragmentaire. De nombreuses études concernant la fonction AECII sont effectuées à l'aide de la souris ou l'homme lignées de cellules épithéliales alvéolaires 9-12. Travailler avec des lignées de cellules offre certes de nombreux avantages, tels que la disponibilité d'un grand nombre of cellules pour des analyses approfondies. Cependant, nous croyons que l'utilisation de AECII murin primaire permet une meilleure compréhension du rôle de ce type de cellules dans des processus complexes comme l'infection ou une inflammation auto-immune. Primaire AECII murin peut être isolé directement à partir d'animaux qui souffrent de ces affections respiratoires, ce qui signifie qu'ils ont été soumis à tous les autres facteurs extrinsèques jouent un rôle dans la mise en analysés. A titre d'exemple, AECII viable peut être isolé à partir des souris infectées par voie intranasale avec le virus de la grippe A, qui touche principalement les cellules à la réplication 13. En outre, grâce infection ex vivo de AECII isolés de souris saines, l'étude des réponses cellulaires montés lors de l'infection peut être prolongée.
Notre protocole pour l'isolement de AECII murin primaire est basée sur la digestion enzymatique de la souris suivies par les poumons d'étiquetage de la suspension cellulaire obtenue avec des anticorps spécifiques de CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 et CD16/CD32. AECII granulaires sont ensuite identifiés comme non marqué et la dispersion latérale élevée (SSC haut) et population de cellules sont séparées par tri cellulaire activé par fluorescence 3.
En comparaison à d'autres méthodes d'isolement de cellules primaires épithéliales de poumons de souris, notre protocole d'isolement par cytométrie de flux AECII par sélection négative donne intacte, très viable et pur AECII dans un temps relativement court. En outre, et contrairement aux méthodes conventionnelles d'isolement par le panoramique et l'épuisement des lymphocytes par l'intermédiaire de la liaison de l'anticorps couplés billes magnétiques 14, 15, cytométrie en flux de tri cellulaire permet la discrimination par le biais de la taille des cellules et la granularité. Étant donné que l'instrumentation pour le tri cellulaire par cytométrie en flux est disponible, la procédure décrite peut être appliquée à des coûts relativement faibles. Suivant les anticorps et les enzymes standards pour la désintégration du poumon, pas de réactifs supplémentaires tels que magnétiqueperles sont nécessaires. Les cellules isolées sont adaptés à un large éventail d'études fonctionnelles et moléculaires, notamment la culture in vitro et des essais de stimulation des cellules T ainsi que transcriptome, du protéome ou des analyses sécrétome 3, 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre protocole pour l'isolement des murin AECII par cytométrie en flux offre un moyen rapide d'accéder à des cellules primaires du poumon de souris pour toute une série d'études fonctionnelles et moléculaires. La procédure décrite donne populations très viables et pure de AECII qui sont en nombre suffisant pour les analyses ultérieures directes, telles que l'ARN isolés (voir figure 2b) et l'étude du transcriptome. Pour les applications fonctionnelles, il est également p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier M. Höxter d'assistance technique dans le tri primaire AECII murin de niveau de biosécurité 2 échantillons.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation allemande de recherche (DFG) à DB (SFB587, TP B12 et BR2221/1-1) et une bourse de l'École Hanovre recherche biomédicale (DFG CGC 108) à AA. DB est soutenu par l'Initiative du Président et du Fonds de réseautage de l'Association Helmholtz des centres de recherche allemands (HGF), sous le numéro de contrat W2/W3-029.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
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