Dans ce rapport, nous démontrons les étapes de coloration et de l'analyse d'un test de phénotypage réalisé sur sang total frais d'énumérer les principaux innées et adaptatives des populations leucocytaires. Nous insistons sur des considérations d'effectuer ces procédures dans le cadre d'un essai clinique multicentrique.
La cryoconservation des leucocytes du sang périphérique est largement utilisé pour conserver des cellules pour les évaluations de la réponse immunitaire dans les essais cliniques et offre de nombreux avantages pour la facilité et la standardisation des évaluations immunologiques, mais les effets néfastes de ce processus ont été observés sur certains sous-ensembles de cellules, telles que les granulocytes, les lymphocytes B , les cellules dendritiques et 1-3. Le dosage de leucocytes frais donne une image plus précise de l'état dans vivo des cellules, mais il est souvent difficile à réaliser dans le cadre de vastes essais cliniques. Dosages de cellules fraîches dépendent des engagements volontaires et des délais, et si de temps, leur application peut être impossible en raison des heures de travail requis du personnel de laboratoire. En outre, lorsque les essais sont effectués dans plusieurs centres, les laboratoires avec les ressources et la formation nécessaires pour effectuer les dosages peuvent ne pas être situé à proximité suffisante de sites cliniques. Pour répondre à ces questions, nous avons développéloppé un panneau 11-couleur anticorps présentent une coloration qui peut être utilisé avec des tubes Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) au phénotype et énumérer les principales populations de leucocytes dans le sang périphérique, ce qui donne plus robuste de type cellulaire renseignements précis que les tests comme un numération formule sanguine (CBC) ou des tests disponibles dans le commerce avec des panneaux conçus pour les tubes Trucount qui se colorent seulement pour quelques types cellulaires. La procédure de coloration est simple, ne nécessite que 100 ul de sang entier frais, et dure environ 45 minutes, ce qui permettrait aux standards du sang de traitement de laboratoires à effectuer. Il est adapté de la BD du tube Trucount fiche technique ( la version 8/2010 ). Le cocktail d'anticorps coloration peut être préparé à l'avance en vrac à un laboratoire d'analyse central et expédiés aux laboratoires de traitement sur place. Stained tubes peuvent être fixéset congelé pour expédition au laboratoire d'analyse central pour analyse par cytométrie en flux multicolore. Les données générées par ce panneau coloration peut être utilisé pour suivre l'évolution des concentrations de leucocytes dans le temps par rapport à l'intervention et pourrait facilement être développé afin d'évaluer l'état d'activation des types de cellules spécifiques d'intérêt. Dans ce rapport, nous démontrons la procédure utilisée par les techniciens de laboratoire de sang de traitement pour exécuter des taches sur du sang total frais et les mesures pour analyser ces échantillons colorés dans un laboratoire de test central supportant un essai clinique multicentrique. Les détails sur la vidéo de la procédure telle qu'elle est pratiquée dans le cadre d'un prélèvement sanguin essai clinique de vaccin contre le VIH pour les essais Network (HVTN).
Dans ce rapport, nous présentons une méthode basée sur cordon pour le dénombrement des populations de leucocytes dans le sang entier frais par cytométrie en flux et couvrir les paramètres nécessaires à son utilisation dans un essai clinique multicentrique avec analyse de l'échantillon centralisée. Cette méthode s'appuie sur le protocole et optimise BD Trucount et permet son utilisation fiable dans un cadre essai clinique multicentrique. L'essai de coloration est simple et prend environ 45 minutes …
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain et Stephen Voght pour leur aide dans l'élaboration de cette méthode, manuscrits et vidéo.
Ce travail a été soutenu par la Fondation Bill et Melinda Gates CAVD subvention 38 645 (MJM) et les Instituts nationaux de la santé de subventions UM1 AI068618 et AI069481 U01 (MJM). EA-N. est soutenu par des subventions du NIH T32 AI007140. Nous remercions le James B. Pendleton Charitable Trust pour leur don généreux équipement.
Reagent Name | Company | Catalogue number |
Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 |
10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 |
Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 |
CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 |
CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 |
CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 |
CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 |
HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 |
CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 |
CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 |
CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 |
CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 |
CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 |
CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |