プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性前駆細胞は増殖<em> in vitroで</em>ニューロンおよびアストロサイトに分化する能力を維持しています。この作品は、神経前駆細胞がselect増殖因子とコンディショニングによってoligodendrocytic系統の段階を経て分化誘導することができることを示しています。
神経細胞とグリア細胞型へのヒト神経前駆細胞の分化は、神経細胞系譜開発の分子調節を研究し、比較するためのモデルを提供しています胎児の中枢神経系組織からの神経前駆細胞の in vitro での展開では 、十分に特徴付けされています。種々の培養条件の成人ヒト皮質下白質と開発からオリゴデンドロサイトを産生するミエリンに胎児の神経前駆細胞の分化に直接グリア前駆細胞の同定および単離にもかかわらず、in vitroの実験で 、人間のために十分なオリゴデンドロサイトを獲得することは依然として困難である。ガラクトセレブロシドの分化+(GalC)及びO4 +神経前駆細胞からのオリゴデンドロサイト前駆体または前駆細胞(OPC)の妊娠中期胎児の脳を使用して報告されている。しかしながら、これらの細胞はアストロサイトとニューロンを含む支持細胞の非存在下で増殖しないし、文化の中で時間をかけて迅速に失われる。必要性は 、in vitro の実験で適したオリゴデンドロサイト系譜の細胞を産生する培養システムのために残してあります。
初代ヒトオリゴデンドロサイトの培養は、例えば、 生体内でそれらの細胞に感染し、ヒトポリオーマウイルス、JCVのような神経親和性感染因子の病因を研究するための有用なモデルである可能性があります。これらの培養細胞は、中枢神経系(CNS)の他の脱髄疾患のモデルを提供することができます。神経細胞(前駆細胞由来のニューロンは、PDN)とアストロサイトに分化する能力を維持しながら、プライマリ、ヒト胎児脳由来、多能性神経前駆細胞をin vitro で増殖(前駆細胞由来アストロサイト、PDA)、本研究では、神経前駆細胞を誘導できることを示していますoligodendrocytic系統の発展段階(前駆由来オリゴデンドロサイトは、PDO)の多くを介して区別することができます。 DMEM-F12無血清培地中で私たちの文化の神経前駆細胞はsup塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、血小板由来増殖因子(PDGF-AA)、ソニックヘッジホッグ(Shh)、神経栄養因子(NT-3)、N-2とトリヨードサイロニン(T3)とで可能です。培養細胞は、およそ7日ごとに75センチメートルフラスコあたり2.5e6細胞で継代されています。これらの条件を用いて、培養中の細胞の大多数は少数のプロセスとそのようなA2B5およびO-4などの事前オリゴデンドロサイト細胞の急行マーカーによって特徴形態を維持。我々は4つの成長因子(GF)(bFGFは、PDGF-AA、Shhを、NT-3)を削除し、PDNからの馴化培地を追加すると、細胞は、GalCおよびミエリンなどのオリゴデンドロサイト分化の特定の複数のプロセスおよびエクスプレスマーカーを取得するために開始塩基性タンパク質(MBP)。我々は、オリゴデンドロサイトのユニークなマーカーを同定するために多色フローサイトメトリーを用いて表現型の特性評価を行った。
このプロトコルは、初代ヒト神経前駆細胞から胎児オリゴデンドロサイトを導出し、フローサイトメトリーと免疫蛍光染色の両方を使用して、その表現型を特徴付ける方法について説明します。胎児の中枢神経系から神経前駆細胞の拡大と成長は非常によく、1から4に記載されている。しかし、in vitro の実験で 、人間のために十分なオリゴデンドロサイト…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、米国立衛生研究所(NIH)、NINDSにおける学内研究プログラムによってサポートされていました。著者は、編集を手伝って顕微鏡とパメラCのふるいで助けるために分子医学と神経科学、リック·ドレイファスの研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
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Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |