الأولية، والإنسان الجنين الدماغ المستمدة، تتكاثر الخلايا الاصلية multipotential<em> في المختبر</em> مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى خلايا عصبية والخلايا النجمية. هذا العمل يدل على أن يمكن أن يتسبب الأسلاف العصبية للتميز من خلال مراحل النسب oligodendrocytic من تكييف عوامل النمو مختارة.
التفريق بين الأسلاف العصبية الإنسان في أنواع الخلايا العصبية والدبقية تقدم نموذجا للدراسة والمقارنة بينها تنظيم الخلية العصبية الجزيئية للتنمية النسب. في توسيع المختبر من الأسلاف العصبية من الأنسجة الجنينية CNS اتسمت أيضا. على الرغم من تحديد وعزل الأسلاف الدبقية من الكبار المسألة الفرعية القشرية الإنسان الأبيض وتطور الأوضاع المختلفة لثقافة التمييز المباشر من الأسلاف العصبية الجنينية في إنتاج oligodendrocytes قد المايلين، والحصول على oligodendrocytes قد البشرية الكافية لفي المختبر التجريب لا يزال صعبا. التفريق بين غالاكتوسيريبروزيد + (GalC) وO4 + تم الإبلاغ عن السلائف دبقية قليلة التغصن أو الخلايا الاصلية (OPC) من الخلايا العصبية باستخدام السلائف 2 الثلث الدماغ الجنين. ومع ذلك، فإن هذه الخلايا لا تتكاثر في غياب الخلايا النجمية بما في ذلك دعم والخلايا العصبية، وسرعان ما فقدت مع مرور الوقت في الثقافة. لا تزال الحاجة لنظام الثقافة لإنتاج خلايا دبقية قليلة التغصن من سلالة مناسبة لفي التجريب المختبر.
يمكن أن ثقافة الإنسان oligodendrocytes قد الابتدائي، على سبيل المثال، تكون نموذجا مفيدا لدراسة العوامل المعدية التسبب في الموجهات العصبية مثل الفيروسة التورامية الإنسان، JCV، في الجسم الحي أن يصيب تلك الخلايا. يمكن لهذه الخلايا المستزرعة توفر أيضا نماذج من الأمراض الأخرى المزيل من الجهاز العصبي المركزي (CNS). الأولية، والجنين البشري الدماغ المستمدة، multipotential تتكاثر الخلايا الاصلية العصبية في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى خلايا عصبية (عصبونات السلف المستمدة، PDN) والخلايا النجمية (المشتقة من الخلايا النجمية السلف، PDA) تظهر هذه الدراسة أن يمكن أن يتسبب الأسلاف العصبية للتميز من خلال العديد من مراحل التنمية النسب oligodendrocytic (السلف المستمدة من oligodendrocytes قد، PDO). نحن الخلايا العصبية الثقافة السلف في وسائل الإعلام المصل خالية DMEM-F12 سوبplemented مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، الصفائح الدموية المستمدة عامل النمو (PDGF-AA)، القنفذ الصوتي (SHH)، وعامل التغذية العصبية 3 (NT-3)، N-2 و triiodothyronine (T3). وpassaged في الخلايا المستزرعة في خلايا 2.5e6 في قوارير 75CM تقريبا كل سبعة أيام. باستخدام هذه الشروط، فإن غالبية الخلايا في الثقافة حفاظ على مورفولوجيا تتميز بعض العمليات وعلامات صريحة من قبل خلايا دبقية قليلة التغصن، مثل A2B5 وO-4. عندما كنا إزالة عوامل النمو الأربعة (GF) (bFGF، PDGF-AA، SHH، NT-3) وإضافة وسائط مكيفة من PDN، تبدأ الخلايا للحصول على مزيد من العمليات وعلامات صريحة محددة من التمايز دبقية قليلة التغصن، مثل GalC والمايلين الأساسية البروتين (MBP). أجرينا توصيف المظهري باستخدام متعدد الألوان التدفق الخلوي لتحديد علامات فريدة من دبقية قليلة التغصن.
هذا البروتوكول يصف كيفية اشتقاق oligodendrocytes قد الجنين من المرحلة الابتدائية خلايا العصبية السلف وتميز النمط الظاهري وذلك باستخدام كل من التدفق الخلوي المناعي وتلطيخ. وقد تم توسيع ونمو الأسلاف العصبية من الجهاز العصبي المركزي الجنين بشكل جيد للغاية ووصف 1-4. ومع ذ?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث ضمن الجدران في المعاهد الوطنية للصحة، NINDS. فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء مختبر الطب الجزيئي وعلم الأعصاب، ريك درايفوس لمساعدة مع المجهري وباميلا النخل C. لمساعدة مع التحرير.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |