Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경
Summary
아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록 설계되었습니다<em> O</em> – GlcNAz. 각각의 azide 그룹 chemoselectively 바이러스 표면 개조의 수단으로 "클릭"화학 반응을 통해 출혈도 잡았있다.
Abstract
바이러스 입자의 수정은 유전자 치료, oncolytic 응용 프로그램 및 백신 개발에 영향을 미치는위한 엄청난 잠재력에 대한 관심의 상당 금액을 받았습니다. 대부분은 유전학 기반입니다 바이러스 표면, 수정에 1,2,3 전류 접근법은 종종 감쇠에 걸리다 바이러스 생산, 감염 및 세포 형질 도입. 4,5 chemoselective 클릭 화학을 사용하여, 우리는 매우 유연하고 접근을 모두 유지하면서 이러한 문제를 sidesteps 간단한 대안적인 접근 방식을 개발했습니다. 1,2
이 프로토콜의 목표는 아데노 바이러스 타입 5 입자의 표면을 수정 bioorthogonal 클릭 화학을 이용의 효율성을 입증하는 것입니다. 그것이 단백질에 타겟팅 분자, 염료 또는 관심있는 다른 분자의 chemoselective 결합을 허용으로이 두 단계 프로세스는 모두 therapeutically 1 또는 analytically, 2,6 사용할 수 있습니다azide 태그로 미리 분류. 이 방법의 세 가지 주요 장점은 (1) 신진 대사 라벨링은 바이러스성 적합성에 영향, 1,7에 약간을 보여주는 것이있다 (2) 효과기 리간드의 다양한 배열이 활용될 수 있으며, (3) 그것은 매우 빠르고, 신뢰할 수있다 액세스가 용이합니다. 1,2,7
이 절차의 첫 단계에서 아데노 바이러스 입자는 기능 azide (-N 3)를 포함 둘 다 azidohomoalanine (아하, 메티오닌 대리) 또는 부자연스러운 설탕 O-연결된 N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz) 중 하나를 베어링 생산됩니다 그룹. azide으로 수정한 바이러스 입자의 정화 후, 형광 TAMRA 잔기를 포함하는 alkyne 프로브 미리 표시된 단백질이나 glycoproteins에 chemoselective 방식으로 출혈도 잡았있다. 마지막으로, SDS-PAGE 분석은 바이러스 capsid 단백질에 프로브의 성공적인 결합을 설명하기 위해 수행됩니다. 아하의 설립은 모든 바이러스 capsid를 붙여 표시됩니다단백질 (Hexon, Penton 및 섬유), 전용 섬유의 라벨에있는 O-GlcNAz의 설립 결과 동안.
이런 진화 필드에 azide – alkyne 내고 여러 가지 방법이 성공적으로 개발되었습니다 있지만 우리가 가장 편리한 것으로 나타났습니다만이 두 사람은 본 시연 – 스트레인 추진 azide – alkyne의 cycloaddition (SPAAC)과 구리 촉매 azide – alkyne의 cycloaddition (CuAAC) deoxygenated 분위기 하에서.
Protocol
Discussion
azides의 포함 chemoselective 및 bioorthogonal 클릭 반응,의 개발 연구가 빠르게 진화 영역이며, 이후 bioconjugation 어플 리케이션에 선택할 수있는 이러한 반응의 증가가있다. 우리는 우리 자신의 실험실 및 모든 시약의 상업적인 가용성으로 인해 그들의 유용성 때문에 선택받은 단 두 가지 방법을 포함하도록이 프로토콜의 범위를 제한했습니다.
최초의 루트에서는 – 스트레인 추진 azi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 기금 (CBET-0846259)에 대한 NSF 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
References
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