Adenovirus deeltjes zijn ontworpen om zowel de onnatuurlijke aminozuur analoog azidohomoalanine of de azido suiker bevatten<em> O</em>-GlcNAz. De azide groep elk is chemoselectively geligeerd via "klik" chemische reacties als middel van virale oppervlaktemodificatie.
De wijziging van virusdeeltjes heeft een aanzienlijk deel van de aandacht voor zijn enorme potentieel voor invloed gentherapie, oncolytische toepassingen en de ontwikkeling van vaccins. 1,2,3 huidige aanpak op de wijziging van virale oppervlakken, die meestal op basis van de genetica, vaak last van demping van het virus productie, infectiviteit en cellulaire transductie. 4,5 Met behulp van chemoselectieve klik chemie, hebben we een duidelijke alternatieve benadering, waarin deze aspecten omzeilt, terwijl de resterende zowel zeer flexibel en toegankelijk. 1,2
Het doel van dit protocol is om aan te tonen de effectiviteit van het gebruik van bioorthogonal klik chemie aan de oppervlakte van adenovirus type 5 deeltjes te wijzigen. Deze twee stappen kunnen zowel therapeutisch 1 of analytisch, 2,6 worden gebruikt als het zorgt voor chemoselectieve ligatie van targeting moleculen, kleurstoffen of andere moleculen van belang op eiwittengelabelde met azide tags. De drie grote voordelen van deze methode zijn dat (1) metabole etikettering weinig tot geen invloed op de virale fitness, 1,7 laat zien (2) een brede waaier van effector liganden kan worden gebruikt, en (3) het is opmerkelijk snel, betrouwbaar en makkelijk te bereiken. 1,2,7
In de eerste stap van deze procedure worden adenoviruspartikels geproduceerd met een azidohomoalanine (Ha een methionine surrogaat) of onnatuurlijke suiker O-gekoppelde N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), die beide de azide (N-3) functionele groep. Na zuivering van azide gemodificeerde virus deeltjes wordt een alkyn probe met de fluorescerende TAMRA groep geligeerd in chemoselectieve wijze de pre-gemerkte eiwitten of glycoproteïnen. Tenslotte is een SDS-PAGE analyse uitgevoerd om de succesvolle ligatie van de probe aangetoond op het virale capside eiwitten. Aha opname wordt getoond aan alle virale capside-labeleiwitten (Hexon, Penton en Fiber), terwijl O-GlcNAz opname resulteert in de etikettering van Fiber alleen.
In deze ontwikkelende gebied zijn er verschillende methoden voor het azide-alkyn ligatie met succes ontwikkeld, maar alleen de twee die we hebben gevonden zijn meest handige handleiding worden aangetoond – stam-bevorderd azide-alkyn cycloadditie (SPAAC) en koper-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC) onder zuurstofarme atmosfeer.
De ontwikkeling van chemoselectieve en bioorthogonal klik op reacties, waaronder die van aziden, is een zich snel ontwikkelende gebied van onderzoek, en vervolgens is er een groeiend aantal van deze reacties om uit te kiezen voor bioconjugation toepassingen. We hebben de reikwijdte van dit protocol om slechts twee methoden die werden omwille van hun nut gekozen in ons eigen lab en de commerciële beschikbaarheid van alle reagentia op te nemen.
In de eerste van deze route – stam-bevorderd azi…
The authors have nothing to disclose.
We willen de NSF voor financiering (cbet-0846259) erkennen.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
Cell culture CO2 incubator | ||
Hemocytometer | ||
Biosafety cabinet | ||
Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
Sterile needle, 18 gauge | ||
Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
Dewar flask | ||
Liquid nitrogen | ||
Electrophoresis cell | ||
Fluorescent gel scanner | ||
Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
Thermo Scientific | 88905 | |
Sigma-Aldrich | A7480 | |
Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
Methanol | ||
Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | ||
1M HCl | ||
Glycerol | ||
Bovine Serum Albumin | ||
L-cysteine | ||
L-methionine | ||
SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
2-mercaptoethanol | ||
Glycine | ||
Bromophenol blue | ||
Cesium Chloride (CsCl) | ||
Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
Calcium Chloride (CaCl2) | ||
Potassium Chloride (KCl) | ||
Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
Sodium Chloride (NaCl) | ||
Alkyne probe for CuAAC* | ||
TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.