全細胞集団の単一細胞レベルでサイクリンBの分解を勉強
Summary
後期促進複合体（APC / C）依存性ユビキチン化とここサイクリンBのその後の破壊によってトリガされ移行を後期にかけてする中期、我々は、パルスチェイスラベルに続いて、システムを構築し、全体の細胞集団でサイクリンB蛋白質分解を監視することができ、有糸分裂チェックポイントによる干渉の検出を容易にする。
Abstract
細胞分裂時に2つの娘細胞の間で染色体の均等分配は遺伝的安定性1を保証するための前提条件です。染色体分離時の不正確さは、悪性腫瘍の特徴であり、進行性の疾患で2月4日に関連付けられている。スピンドルアセンブリチェックポイント（SAC）は、一つ一つの染色体が紡錘体1への安定したバイポーラ·アタッチメントを決めるまで戻って中期の細胞を保持分裂サーベイランス·メカニズムです。 SACはこうしてsecurinとサイクリンBの分解と染色体分離と有糸分裂の出口をブロックするために活性化APC / CサブユニットCdc20との干渉によって、その機能を発揮する。染色体の不適切な添付ファイルは、SACシグナルのサイレンシングを防止し、問題が染色体missegregation、異数性および悪性増殖1を回避するために解決されるまで、APC / C Cdc20の継続的な阻害を引き起こす。
私宛のほとんどの研究APC / C依存性タンパク質分解に不適切な染色体付着のnfluenceは、微小管への染色体付着を妨害する薬剤を解重合または微小管安定化を用いたスピンドルの混乱を利用しました。微小管の動態との干渉が重要な調節因子の輸送と局在に影響を与えることができるので、これらの手順は、人工的な効果5を誘発するリスクを負うものとします。
SACは細胞集団を動じに有糸分裂時にAPC /サイクリンBのC依存性タンパク質分解を妨害する方法を勉強するために、我々は、有糸分裂染色体とサイクリンB 6のタンパク質分解の中期アライメントの同時モニタリングを許可されたヒストンH2-GFPベースのシステムを確立。
タンパク質分解プロファイルを表現するために、我々は、C末端SNAPの部分6（ 図1）とキメラサイクリンBレポーター分子を生成しました。自己標識反応では、SNAP-部分はと共有結合を形成することが可能であるグアニンキャリア（SNAP基板）7,8（ 図1）。 SNAPの基質分子は容易に入手可能であり、異なる蛍光色素の広いスペクトルを運ぶ。キメラサイクリンB-SNAPの分子は、成長培地7（ 図1）への膜透過性のSNAP基質の添加により標識されたようになります。標識反応に続いて、サイクリンB-SNAPの蛍光強度は、パルスチェイス反応のような方法と蛍光強度の低下サイクリンB劣化6（ 図1）のレベルを反映しています。我々のシステムは並行してセル（またはいくつかの細胞集団）の多数の分裂APC / C依存性タンパク質分解のモニタリングを容易にする。これにより、システムは、エージェント/遷移をする中期後期にかけてでタンパク質分解活性を妨害することができる小分子を同定するための貴重なツールであるかもしれません。また、有糸分裂時のサイクリンBの合成として最近重要mechanisとして示唆されている9,10安定したサイクリンBの発現レベルを維持することによって、マウスとヒトの分裂ブロックの育成にmが、このシステムは、バランスのとれた均衡6の一つの要素として、サイクリンB蛋白質分解を分析することができました。
Protocol
Discussion
我々はここでサイクリンB蛋白質分解と染色体のアライメントの同時モニタリングを促進するライブセルイメージングベースのアプローチを提示します。このアプローチは、単一細胞レベルでの細胞集団を非摂動の分裂制御の研究を可能にします。サイクリンBの劣化曲線は、APC / Cの活性に直接的な洞察を促進するため、間接的にSAC 6のステータスを反映します。
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々はpLPCX-ヒストンH2-GFPプラスミドを提供するため、S.テイラーに感謝しています。我々は継続的な支援のためにR. Mertelsmannに感謝します。この作品は、ドイツ学術振興によってサポートされていました。
Materials
| Name of product | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
- Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).
