Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere
Summary
Metafase di anafase transizione viene attivato attraverso la promozione anafase-complesso (APC / C)-dipendente ubiquitinazione e la successiva distruzione della ciclina B. Qui, abbiamo creato un sistema che, a seguito di pulse-chase etichettatura, permette di monitorare ciclina proteolisi B in popolazioni di cellule intere e facilita la rilevazione di interferenza del checkpoint mitotico.
Abstract
Distribuzione uniforme dei cromosomi tra le due cellule figlie durante la divisione cellulare è un prerequisito per garantire la stabilità genetica 1. Imprecisioni in fase di separazione dei cromosomi sono una caratteristica di malignità e associata a progressione della malattia 2-4. Il checkpoint del fuso (SAC) è un meccanismo di controllo mitotico che trattiene le cellule in metafase fino a quando ogni singolo cromosoma ha stabilito un legame stabile bipolare al fuso mitotico 1. La SAC esercita la sua funzione per interferenza con l'attivazione di APC / C subunità Cdc20 di bloccare la proteolisi di securin e ciclina B e quindi la separazione dei cromosomi e uscire mitotico. Attacco improprio dei cromosomi impedisce di mettere a tacere SAC segnalamento e provoca l'inibizione segue da APC / C Cdc20 fino a quando il problema è risolto per evitare missegregation cromosoma, aneuploidia e carcinomi 1.
La maggior parte degli studi che hanno affrontato il influence improprio di attaccamento cromosomica su APC / C-dipendente proteolisi ha approfittato di interruzione del mandrino utilizzando depolimerizzante o microtubuli stabilizzazione farmaci di interferire con l'attaccamento cromosomica ai microtubuli. Poiché interferenze con cinetiche microtubuli può influenzare il trasporto e la localizzazione dei regolatori critici, queste procedure sopportare un rischio di indurre effetti artificiali 5.
Per studiare come la SAC interferisce con APC / C-dipendente della ciclina B proteolisi durante la mitosi in imperturbabile popolazioni cellulari, abbiamo stabilito un sistema di istoni H2-GFP-base che ha permesso il monitoraggio simultaneo di allineamento metafase dei cromosomi mitotici e proteolisi della ciclina B 6 .
Per rappresentare profili proteolitici, abbiamo generato una molecola chimerica B ciclina reporter con una porzione C-terminale SNAP 6 (figura 1). In una reazione di auto-etichettatura, la SNAP-porzione è in grado di formare legami covalenti conalkylguanine-vettori (substrato SNAP) 7,8 (Figura 1). Molecole substrato SNAP sono facilmente disponibili e trasportare un ampio spettro di differenti fluorocromi. Chimerici ciclina B-SNAP molecole diventano etichettati dopo aggiunta della membrana permeabile substrato SNAP al mezzo di crescita 7 (Figura 1). Dopo la reazione di marcatura, l'intensità ciclina B-SNAP fluorescenza gocce in un pulse-chase reazione modo simile e intensità di fluorescenza riflettere livelli di ciclina B degradazione 6 (figura 1). Il nostro sistema facilita il monitoraggio della mitotico APC / C-dipendente proteolisi in un gran numero di cellule (o più popolazioni di cellule) in parallelo. In tal modo, il sistema può essere un valido strumento per identificare agenti / piccole molecole che sono in grado di interferire con l'attività proteolitica in metafase per anafase transizione. Inoltre, come sintesi di ciclina B durante la mitosi è stato recentemente proposto come un mechanis importantim nel promuovere un blocco mitotico nei topi e negli esseri umani, mantenendo stabili i livelli di espressione della ciclina B 9,10, questo sistema ci ha permesso di analizzare proteolisi B ciclina come uno degli elementi di una situazione di equilibrio 6.
Protocol
Discussion
Vi presentiamo qui un live-cell approccio di imaging basata facilitare il monitoraggio simultaneo di proteolisi ciclina B e l'allineamento dei cromosomi. Questo approccio permette lo studio del controllo mitotico negli imperturbabile popolazioni cellulari a livello di singola cellula. Curve di degradazione della ciclina B facilitare intellezioni dirette nell'attività della APC / C e quindi indirettamente riflettere lo stato della SAC 6.
Questo approccio, pur calcolato sul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a S. Taylor per la prestazione del pLPCX-istoni H2-GFP plasmide. Ringraziamo R. Mertelsmann per il supporto continuo. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
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