Rekombinant gelen kolesterol bağlayıcı toksin Streptolizin O arındırıcı Yöntemleri<em> E. coli</emÖkaryotik hücrelerin canlı bağlanabilen toksininin> ve görüntüleme tarif edilmektedir. Toksin Lokalize teslimat toksin biyoloji romanı yönlerini açığa hedeflenen hücrelerde hızlı ve karmaşık değişikliklere sebep olur.
Bakteriyel toksinler hücresel içeriği ve dış ortamdan malzemelerin akını sızıntı izin gözenekleri oluşturan, zarlarında kolesterol bağlamak. Hücre ya aktif zarı tamir işlemleri gerektiren bu hakaret, kurtarmak, ya da başka bir toksine maruz kalma ve hücre tip 1 miktarına bağlı olarak ölebilir. Buna ek olarak, bu toksinlerin pro-inflamatuvar sitokinlerin 2 bir dizi üretmek makrofajlar dahil immün hücrelerin aktivasyonu yoluyla enfekte barındıran güçlü inflamatuar yanıtı indükler. Pek çok Gram pozitif bakteriler, büyük ölçüde karakterize olmamış mekanizmalar yoluyla virülans katkı gösterilmiştir kolesterol bağlayıcı toksinler üretirler.
Bu toksinlere maruz hücrelerin plazma membranında Morfolojik değişiklikler intrinsik hücresel savunma düşündüren, ekstrasellüler boşluğa döken olabilir kolesterol bakımından zengin yüzey çıkıntıları, onların haciz dahilmekanizması 3,4. Bu işlem, metabolik etkinlik yokluğunda tüm hücrelerde meydana gelir, ve kimyasal tespit sonra 4 EM kullanılarak görüntülenebilir. Böyle toksine maruz kalma yanıt olarak inflamasyon aracılık makrofaj gibi immün hücrelerde indüklenen membran veziküller IL-1 ailesi sitokinler içermesi önerilmektedir ve toksin atma ve bu pro-inflamatuar sitokinler 5,6,7 yaymak için hem de sorumlu olabilir. Hem 8 kaspaz-1 bağımlı süreçlerin gibi IL-1β salınımı ve hücre ölümü belirli bir türü arasında bir bağlantı, adlandırdığı pyroptosis ileri sürülmüştür. Membran vezikül toksin bağlayıcı, dökülme, sitokin salınımı, ve potansiyel olarak hücre ölümü içeren bu makrofaj yanıtı, karmaşıklığı çözmek için, biz de dahil olmak üzere, toksin-hücre etkileşimleri gerçek zamanlı görselleştirme için izin etiketleme teknikleri ve floresans mikroskobu yöntemleri geliştirmişlerdir fonksiyon bozukluğu ve ölüm ölçümleri (Şekil 1). Kullanmakcanlı hücre görüntüleme diğer teknikleri sınırlamaları nedeniyle gereklidir. Flow sitometri bireysel hücrelerin yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görselleştirme sunmaz ise Biyokimyasal yaklaşımlar, bireysel hücrelerin meydana etkilerini çözemez. Burada açıklanan yöntemlerle hücrelerde kompleks fenotip değişiklikleri içeren başka bir uyarıya bağlı yanıt kinetik analizi için uygulanabilir.
Teknikleri bakteriyel toksinler bağışıklık hücrelerinin yanıtların incelenmesine olanak burada açıklanan. En kritik adım toksin kullanım ve dozaj olduğunu. Toksin aktivitesi hatta kırılganlık dolayı aynı hazırlanması farklı alikotları arasında, son derece değişken olabilir. Bu ya bir referans hücre hattı veya RBCs karşı toksin her kısım test veya toksin gradyanlar kullanarak gerektirir. Toksin gradyanlar gibi mikropipet tarafından teslim, gerçek zamanlı olarak uyulması gereken toksin k…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar teknik yardım SLO plazmid ve Jonathan Franks cömert hediye için anthrolysin O, Michael Caparon ve cömert bir hediye için Richard istirahat teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe T32CA82084 (PAK) ve R01AI072083 (RDS) tarafından finanse edildi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | ||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |||||||||||||||||||
polymixin-agarose | Sigma | P1411-5ML | |||||||||||||||||||
Zeba Desalt Spin col | Fisher | PI-89891 | |||||||||||||||||||
sheep RBCs | Fisher | 50-415-688 | |||||||||||||||||||
pBADgIII-SLO | N/A | N/A | see ref9 | ||||||||||||||||||
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | |||||||||||||||||||
Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |||||||||||||||||||
Calcein AM/ Ethidium homodimer | Life Technologies | L3224 | |||||||||||||||||||
Anti-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |||||||||||||||||||
collagen-coated glass-bottom dish | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |||||||||||||||||||
femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |||||||||||||||||||
Microloader | Fisher | E5242956003 | |||||||||||||||||||
dextran Alexa 555 | Life Technologies | D34679 | |||||||||||||||||||
Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |||||||||||||||||||
FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |||||||||||||||||||
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed. |
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed. |