Verfahren zur Reinigung des Cholesterins Bindung Toxin Streptolysin O aus rekombinanten<em> E. coli</em> Und Visualisierung von Toxin Bindung an eukaryotischen Zellen leben beschrieben. Lokalisierte Abgabe von Toxin induziert eine schnelle und komplexe Veränderungen in Zielzellen enthüllen neue Aspekte des Toxins Biologie.
Bakterielle Toxine binden an Cholesterin in Membranen, Bildung von Poren, die auf Undichtigkeiten des Zellinhalts und Einströmen von Material von der äußeren Umgebung ermöglichen. Die Zelle kann entweder ins Insult, die Wirkmembran Reparaturprozesse erfordert wiederherzustellen, oder sterben abhängig von der Menge des Toxins Belichtung und ein Zelltyp. Darüber hinaus führen diese Toxine starke entzündliche Reaktionen in infizierten Wirten durch Aktivierung von Immunzellen, einschließlich Makrophagen, die ein Array von pro-inflammatorischen Zytokinen 2 zu erzeugen. Viele Gram-positive Bakterien produzieren Cholesterin bindenden Toxine, die gezeigt haben, um ihre Virulenz durch weitgehend charakterisierten Mechanismen beitragen.
Morphologischen Veränderungen in der Plasmamembran von Zellen, die diese Toxine umfassen ihre Sequestrierung in Cholesterin angereicherten Oberflächenprotrusionen, die in den extrazellulären Raum vergossen werden kann, was auf eine intrinsische zelluläre AbwehrMechanismus 3,4. Dieser Vorgang geschieht für alle Zellen in Abwesenheit einer metabolischen Aktivität und visualisiert werden kann, nachdem mit EM chemischen Fixierung 4. In Immunzellen wie Makrophagen, die Entzündung als Reaktion auf Exposition Toxin vermitteln, induziert werden Membranvesikel vorgeschlagen, Zytokine der IL-1-Familie enthalten und kann sowohl für vergießen Toxin und Weiterleitung dieser proinflammatorischen Zytokine 5,6,7. Eine Verbindung zwischen IL-1β Freisetzung und einer bestimmten Art von Zelltod genannt hat pyroptosis vorgeschlagen worden, da beide Caspase-1-abhängiger Prozesse sind 8. So sortieren Sie die Komplexität dieser Makrophagen Antwort, die Toxinbindung, vergießen Membranvesikel Zytokinfreisetzung und potenziell Zelltod enthält, haben wir die Kennzeichnung Techniken und Fluoreszenzmikroskopie Methoden, die für Echtzeit-Visualisierung von Toxin-Zell-Interaktionen ermöglichen, einschließlich entwickelt Messungen der Dysfunktion und Tod (Abbildung 1). Verwendendes Live Cell Imaging ist notwendig wegen der Beschränkungen in anderen Techniken. Biochemische Ansätze nicht lösen können auftretenden Effekte in einzelnen Zellen, während Durchflusszytometrie nicht bieten hohe Auflösung, Echtzeit-Visualisierung von einzelnen Zellen. Die hier beschriebenen Methoden können zur kinetischen Analyse der Antworten durch andere Reize mit komplexen phänotypischen Veränderungen in Zellen induziert aufgebracht werden.
Die hier beschriebenen Techniken ermöglichen die Untersuchung der Reaktionen von Immunzellen, um bakterielle Toxine. Der wichtigste Schritt ist die Handhabung und Dosierung des Toxins. Toxinaktivität kann äußerst variabel, sogar zwischen verschiedenen Aliquots derselben Zubereitung, aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit. Dies erfordert entweder eine Prüfung jedes einzelnen Aliquot des Toxins gegen eine Referenz Zelllinie oder RBCs oder mit Toxin Steigungen. Toxin Gradienten, wie Mikropipette geliefert, damit das gesamte …
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei Richard Ruhe für die großzügige Schenkung von anthrolysin O, Michael Caparon für das großzügige Geschenk der SLO Plasmid und Jonathon Franks für die technische Unterstützung bedanken. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse T32CA82084 (PAK) und R01AI072083 (RDS) finanziert.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | ||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |||||||||||||||||||
polymixin-agarose | Sigma | P1411-5ML | |||||||||||||||||||
Zeba Desalt Spin col | Fisher | PI-89891 | |||||||||||||||||||
sheep RBCs | Fisher | 50-415-688 | |||||||||||||||||||
pBADgIII-SLO | N/A | N/A | see ref9 | ||||||||||||||||||
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | |||||||||||||||||||
Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |||||||||||||||||||
Calcein AM/ Ethidium homodimer | Life Technologies | L3224 | |||||||||||||||||||
Anti-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |||||||||||||||||||
collagen-coated glass-bottom dish | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |||||||||||||||||||
femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |||||||||||||||||||
Microloader | Fisher | E5242956003 | |||||||||||||||||||
dextran Alexa 555 | Life Technologies | D34679 | |||||||||||||||||||
Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |||||||||||||||||||
FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |||||||||||||||||||
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed. |
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Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed. |