ここでは、免疫調節活性物質の同定を目指した新規な高含有化学的に誘発される炎症アッセイを説明します。我々は正常、炎症反応だけでなく、さらに、データ処理、解析、マイニング、およびストレージの自動定量化を可能にするカスタム開発したソフトウェアのスクリプトで自動化された顕微鏡を組み合わせています。
に投与したときにゼブラフィッシュの幼虫はその小さなサイズと相対的な操作や観察のしやすさだけでなく、化合物は、単に入浴水に添加することができ、容易に吸収されているという事実に起因する1,2 –全動物の小分子の画面に特に適している<1%DMSO溶液。ゼブラフィッシュの幼虫および白血球の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック系統の可用性の光学的透明性のために、ゼブラフィッシュでは、in vivoでの急性炎症反応を監視するためのユニークな利点を提供します。その結果、高スループットの免疫調節化合物の同定を目指して、高含有量の小さな分子の画面のゼブラフィッシュを利用することは、炎症誘導のシナリオは、フィン組織のローカライズされたニックをEGの卵黄の表面に向けレーザー損傷を示唆する、3-6提案されている胚7または尾翼の切断3,5,6。これらのメソッドの主な欠点は、しかし、であったマニュアル幼虫操作の要件は、このようにハイスループットスクリーニングを防ぐために、負傷を誘導する。化学的に誘発される炎症(顎)アッセイ8の導入は、これらの障害を排除した。負傷を負わされているので、化学的に同時に扱うことができる胚の数は事実上無制限です。硫酸銅とゼブラフィッシュの幼虫の一時的な治療を選択側線系と負傷者neuromastsへの迅速な顆粒球動員の結果の有毛細胞に細胞死を誘導する。炎症反応は、化合物トランスジェニックcldnB :: GFP / lysC ::感丘細胞と同様に、赤色蛍光タンパク質標識顆粒球における緑色蛍光タンパク質を発現DsRed2の6,9ゼブラフィッシュの幼虫を使用してリアルタイムに追跡することができる。
両方の高いコンテンツと高スループット分析を可能にするであろうスクリーニング戦略を考案するために、我々は、ロボット液体ハンドリングと組み合わせた自動化されたMICRを導入しましたカスタム開発されたソフトウェアスクリプトを使用してoscopy。このスクリプトでは、負傷した緑色蛍光neuromastsを取り巻く経験的に定義されたエリア内の赤色蛍光白血球によって占め%の領域を獲得して炎症反応の自動定量化を可能にします。さらに、自動データ処理、処理、可視化、ストレージのすべてのカスタム開発され、MATLABやPythonスクリプトに基づいています。
要するに、我々は、顆粒球の炎症反応の開始、進行や解像度への影響について化学化合物のテストを許可する自動化されたHC / HT画面をご紹介します。このプロトコルは、自然免疫応答のオーケストレーションに関与する薬物のメカニズムと経路のより詳細な分析のための良い出発点を提供しています。将来的には、創薬の初期段階では耐えられない毒性やオフターゲット効果を識別する助けとすることにより薬剤開発のための手続きのリスクとコストを減らすことができます。
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Dimethyl sulphoxide | Carl Roth GmbH & Co KG | A994.2 | |
Copper(II) sulphate anhydrous | Carl Roth GmbH & Co KG | PO23.1 | |
FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
384 microwell plate Non-binding, μClear | Greiner | 781906 | black |
Olympus scan^R | Olympus | ||
Zephyr Compact Liquid Handling Workstation | Caliper |