סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR), ערוץ כלוריד אפיתל, דווחה אינטראקציה עם חלבונים שונים לווסת תהליכים תאיים חשובים, ביניהם את PDZ CFTR מוטיב בתיווך אינטראקציות תועדו היטב. פרוטוקול זה מתאר שיטות שפיתחנו כדי להרכיב macromolecular PDZ תלוי CFTR איתות מורכבת<em> במבחנה</em>.
סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR), ערוץ כלוריד נמצא בעיקר בקרום הפסגה של תאים אפיתל, ממלא תפקיד מכריע הומאוסטזיס נוזל transepithelial 1-3. CFTR היה מעורב בשתי מחלות עיקריות: סיסטיק פיברוזיס (CF) 4 ו הפרשה שלשולים 5. ב CF, סינתזה או פעילות פונקציונלית של CFTR Cl ערוצים מצטמצם. הפרעה זו משפיעה על כ 1 ב 2500 לבנים בארצות הברית 6. פעילות CFTR מוגזם גם היה מעורב במקרים של שלשול, הרעלן המושרה הפרשה (למשל, על ידי רעלן כולרה enterotoxin יציבה חום א coli), אשר ממריץ את ייצור cGMP cAMP או במעיים 7.
צבירת ראיות מציע קיומה של אינטראקציה פיזית בין תפקודי CFTR, ומספר גדל והולך של חלבונים אחרים, כולל מובילי, תעלות יונים, רצפטורים, קינאזות, phosphatases, אותותמולקולות תית, ואלמנטים cytoskeletal, וכן את יחסי הגומלין בין CFTR וחלבונים מחייב שלה הוכחו להיות מעורב באופן קריטי בוויסות CFTR בתיווך התחבורה יון transepithelial במבחנה גם in vivo 8-19. בפרוטוקול זה, אנחנו מתמקדים רק השיטות המסייעים בחקר יחסי הגומלין בין זנב מסוף carboxyl CFTR, אשר מחזיק מוטיב חלבון מחייב [המכונה PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) מוטיב], ו קבוצה של פיגום חלבונים, אשר מכילים מודול מחייב ספציפית המכונה תחומים PDZ. עד כה, כמה חלבונים שונים PDZ הפיגום דווחו להיקשר זנב מסוף carboxyl של CFTR עם זיקות שונות, כגון NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR הקשורים ליגנד), Shank2, ולתפוס 20-27. מוטיב PDZ בתוך CFTR, שמוכר על ידי PDZ פיגום חלבונים הוא האחרון ארבע חומצות אמינו בתחנה הסופית C (כלומר, 1477, DTRL-1480 ב CFTR אדם) 20. מענייןCFTR יכולה לאגד יותר מושלם PDZ של שני NHERFs ו PDZK1, אם כי עם שינוי זיקות 22. Multivalency זה ביחס CFTR מחייב הוכח להיות בעל משמעות תפקודית, דבר המצביע על כך PDZ חלבונים הפיגום יכול להקל על היווצרות macromolecular CFTR איתות קומפלקסים של איתות ספציפיים / סלקטיביים ויעיל בתאים 16-18.
מבחני ביוכימיים רבים פותחו ללמוד CFTR-מעורבים אינטראקציות חלבון, כגון immunoprecipitation משותפת, הנפתח assay, זוג מבחינת assay מחייב, assay colorimetric זוג מבחינת מחייב, והרכבה מורכב macromolecular assay 16-19,28,29 . כאן נתמקד הנהלים המפורטים של הרכבת מוטיב תלוי PDZ CFTR המכיל macromolecular מורכב במבחנה, שבו נעשה שימוש נרחב על ידי המעבדה שלנו ללמוד חלבונים או תחום תחומים אינטראקציות מעורבים CFTR 16-19,28,29.
בפרוטוקול זה הראינו שיטה במבחנה הרכבה זיהוי של CFTR המכיל קומפלקס macromolecular איתות באמצעות חלבונים מטוהרים (או שברי חלבונים) ו / או lysates סלולריים כפי שדווח בעבר 16-19,29,30. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר הנקודות הבאות קריטיות בתהליך ההכנה דורשים התייחסות מיוחדת: …
The authors have nothing to disclose.
העבודה שלנו כבר נתמך על ידי תרומות של איגוד הלב האמריקני (שותפים רבתי דרום מזרח) התחלת-מענק-in-0765185B סיוע, ע 'אלזה Pardee קרן מענק מחקר, ויין סטייט קרן ההפעלה עירונית, לב וכלי דם מכון המחקר איזיס הפרס היוזמה. שיטה זו של באסיפה חוץ גופית CFTR מורכב macromolecular היה במקור חלוץ ידי ד"ר AP Naren (אוניברסיטת טנסי למדעי הבריאות מרכז).
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
pGEX4T-1 vector | GE Healthcare | 28-9545-49 | formerly Amersham Biosciences |
pMAL-C2 vector | New England BioLabs | ||
pET30 vector | EMD Chemicals | 69077-3 | formerly Novagen |
Glutathione agarose beads | BD Biosciences | 554780 | |
Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | |
Talon beads | Clontech | 635501 | |
reduced glutathione | BD Biosciences | 554782 | |
imidazole | Fisher | BP305-50 | |
maltose | Fisher | BP684-500 | |
S-protein agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | formerly Novagen |
Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
Anti-CFTR IgG | Custom-made | R1104 | mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734 |
Anti-MRP2 IgG | Chemicon International | MAB4148 | Now a part of Millipore |
Table 2. Specific reagents and equipment.