ويتم تنظيم الطوبوغرافي الدوائر العصبية في المقصورات وظيفي مع التشكيلات الجزيئية محددة. هنا، ونحن نقدم الخطوات العملية والتقنية للكشف عن العالمية تضاريس الدماغ باستخدام تنوعا wholemount نهج تلطيخ المناعى. نحن إثبات فائدة من طريقة استخدام التهندس الخلوي مفهومة جيدا والدوائر المخيخ.
بنية متكررة ومفهومة جيدا الخلوية من المخيخ جعله نظاما نموذج مثالي لاستكشاف تضاريس الدماغ. الكامنة وراء التهندس الخلوي بصورة موحدة نسبيا هي مجموعة معقدة من المجالات مجاور للسهمي من الجينات والبروتينات. وينعكس هذا التقسيم الجزيئية للمخيخ من قبل المنظمة التشريحية والوظيفية للألياف وارد. لنقدر تماما مدى تعقيد منظمة المخيخ نحن صقلها من قبل نهج تلطيخ wholemount لتحليل إنتاجية عالية من العيوب الزخرفة في المخيخ الماوس. هذا البروتوكول يصف بالتفصيل الكواشف، والأدوات، والخطوات العملية التي هي مفيدة للكشف عن أنماط التعبير بنجاح بروتين في المخيخ فأر بالغ باستخدام wholemount المناعية. سلط الضوء على خطوات تثبت هنا فائدة هذه الطريقة تستخدم للتعبير عن zebrinII / aldolaseC كمثال على الكيفية التي يمكن بها كشف تضاريس الدقيقة للدماغ في تقريرهاأصلي ثلاثي الأبعاد التشكل. كما وصفت هي التعديلات على البروتوكول الذي يسمح لتصور من بروتين تعبير وارد في التوقعات ومخيخات كبير للدراسات المقارنة للالتضاريس الجزيئية. لتوضيح هذه التطبيقات، يتم تضمين البيانات من تلطيخ وارد من المخيخ الفئران.
وقد وصفت لنا التفاصيل الفنية اللازمة لتلطيخ wholemount ناجحة باستخدام نهج متعدد الاستعمالات المناعى للتعبير عن بروتين كاشفة في الدماغ النامية وتعليم الكبار. باستخدام هذا النهج، يمكن تحليل معقد أنماط التعبير الجزيئية وتضاريس الدماغ تقدير من دون الحاجة إلى شاقة وتستغرق ?…
The authors have nothing to disclose.
ويدعم RVS بواسطة محقق جديد لبدء الأموال من كلية ألبرت اينشتاين للطب في جامعة يشيفا.
Materials | Function in protocol |
Perfusion pump (Fisher Scientific/13-876-2) | Allows for consistent and slow perfusion. |
Sharp-tip Scissors (FST/14081-08) | General use in perfusion and dissection. |
Blunt-tip Forceps (FST/91100-12) | To stabilize the heart for insertion of the perfusion needle. |
Forceps (FST by Dumont AA/11210-10) | For use during dissection of the brain from the skull and to separate the cerebellum from the rest of the brain. These are essential because they have a slightly rounded tip that helps minimize damage to the cerebellum during dissection. |
Nutator (Fisher Scientific) | Used to keep tissue in motion during incubation periods. |
1.5 mL tube (Sarstedt/Screw Cap Micro Tube) | All steps of the histochemistry protocol take place in these microtubes. The rounded bottom ensures that the cerebellum stays in motion. |
Perforated spoon (FST/10370-17) | Used to keep wholemounts in the microtubes while gently decanting out the spent solution. |
Leica MZ16 FA microscope | Used to examine wholemount staining. |
Leica DFC3000 FX camera | Used to capture wholemount images. |
Table 1.
Example calendar for a typical wholemount experiment | ||||||||
Day 1 | Dent’s fix, room temperature, 8 hrs | Dent’s bleach, 4°C, overnight | ||||||
Day 2 | 100% MeOH, room temperature, 2x, 30 min each | 100% MeOH, Freeze/thaw, 4x, 30 min/15 min |
100% MeOH, -80°C, overnight | |||||
Day 3 | 50% MeOH/50% PBS, room temperature, 60-90 min | 15% MeOH/ 85% PBS, room temperature, 60-90 min | 100% PBS, room temperature, 60-90 min | 10μg/mL Proteinase K in PBS, room temperature, 2-3 min | 100% PBS, room temperature, 3x, 10 min each | PMT, 4°C, overnight | ||
Day 4-5 | PMT + 1° antibody + 5% DMSO, 4°C, 48 hrs | |||||||
Day 6 | PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each | PMT + 2° antibody + 5% DMSO, 4°C, 24 hours (Or begin amplification steps with ABC complex) | ||||||
Day 7 | PMT, 4°C, 2-3x, 2-3 hrs each | PBT, room temperature, 2 hrs | Incubate in fresh DAB in PBS until optimal staining is visualized |
Table 2.
Recipes (*=prepare fresh every time) | |
PBS (phosphate buffered saline) | 0.1M phosphate buffered saline in deionized water. pH 7.2 (Sigma tablets; P4417) |
PFA (Paraformaldehyde) | Made and stored frozen as a 20% solution and then diluted to 4% in PBS for the working solution (Fisher Scientific; T353) |
Dent’s Fixative3* | 4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) |
Dent’s Bleach3* | 4 parts methanol 1 part dimethylsulfoxide (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 part 30% hydrogen peroxide |
Enzymatic Digestion | 10 μg/ml of Proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) in PBS. |
PBST | PBS containing: 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton can also be used in place of Tween-20 in all instances.) |
PMT25* | PBS containing: 2% nonfat skim milk powder (Carnation preferred) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
PBT25* | PBS containing: 0.2% bovine serum albumin (Sigma; B9001S) 0.1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) |
DAB* | Dissolve one 10-mg tablet of 3,3-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml of PBS. Add 10 μl of 30% hydrogen peroxide to initiate reaction). |
ABC Complex Solution | Vectastain kit (Vector laboratories, Inc; PK-4000) |
Table 3.