השיטה המוצגת כאן מתארת assay לעקוב אחר ההפעלה של RhoA ספציפיים GDP / GTP גורמים חליפין (GEFs) בתאים בתרבית על ידי שימוש בחלבון RhoA GST היתוך מוטציה שיש לו זיקה גבוהה עבור GEFs מופעל. GEFs הם זירז מ lysates סלולריים, שזוהו על ידי סופג המערבי לכמת ידי צפיפות.
חלבונים ממשפחת Rho של GTPases קטנים הם הרגולטורים המרכזיים של cytoskeleton, ולשלוט מגוון רחב של תהליכים תאיים, כולל נדידת תאים, ביטוי גנים, מחזור התפתחות התא הידבקות התא 1. חלבונים Rho הם מתגים מולקולריים הפועלים GTP הנכנס ללא פעילות במדינה תוצר הנכנס. ההפעלה שלהם מתווכת על ידי משפחה של גואנין נוקלאוטיד-פקטור חליפין (GEF) חלבונים. Rho-GEFs מהווים משפחה גדולה, עם חפיפה ספציפיות 2. למרות הרבה הושגה התקדמות בזיהוי GEFs מופעל על ידי אותות ספציפיים, יש עדיין הרבה שאלות שנותרו לגבי רגולציה מסלול ספציפי של חלבונים אלו. מספר Rho-GEFs עולה על 70, ואת כל תא מבטא יותר חלבון GEF. בנוסף, רבים של חלבונים אלה להפעיל לא רק רו, אבל בני משפחה אחרים, שמוסיפים למורכבות של רשתות רגולטוריות. חשוב לציין, לחקוראיך GEFs מוסדרים דורש שיטה כדי לעקוב אחר הבריכה פעילה של GEFs בודדים בתאים מופעל על ידי גירויים שונים. כאן אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד בשיטה שנועדה לבחון ולכמת את הזמינות פעילים Rho-ספציפיים GEFs באמצעות assay משקעים זיקה. Assay זו פותחה לפני שנים אחדות במעבדה Burridge 3,4 ו השתמשנו בו צינורי בכליות שורות תאים 5,6,7. Assay מנצל "נוקלאוטיד חינם" RhoA מוטציה, עם זיקה גבוהה GEFs פעילים. מוטציה (G17A) הופך את החלבון מסוגל להיקשר, או מהתמ"ג GTP וזה המדינה מחקה את מצב ביניים זה חייב GEF. גרסה GST-מתויג של חלבון זה מוטציה באה לידי ביטוי מטוהרים מן ה coli, המאוגדים חרוזים גלוטתיון sepharose ולהשתמש בהם כדי להאיץ GEFs פעילים מ lysates של תאים שלא טופלו ולא מגורה. כמו רוב GEFs מופעלים באמצעות שינויים posttranslational או שחרור מעכבות כריכות, המדינה הפעילהנשמרת lysates סלולריים, והם יכולים להיות מזוהים על ידי assay זה 8. חלבונים שנתפסו יכול להיות נחקר על GEFs מוכרים על ידי זיהוי עם נוגדנים ספציפיים באמצעות סופג המערבי, או מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה לזהות GEFs ידוע מופעל על ידי גירויים מסוימים.
השיטה המוצגת כאן היא זמינה רק שאינו רדיואקטיבי assay הפעלה עבור GEFs שיכולים לעקוב הבריכה פעילה של GEFs בתאים. Assay דומה מבחני משקעים המשמשים ההפעלה הבאה של GTPases קטנים, כמו גם GEFs נגד RAC ו Cdc42. מבחני אלה להשתמש שונים GST-מתוייגים חלבונים ישנם הבדלים קטנים בין 1 המתואר כאן, לעומת זאת השלבים הבסיסיים זהים. כך, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאמים עבור GTPase קטן אחר מבחני GEF ההפעלה.
Assay הציג GEF שונה לאחרונה בקשה שברים גרעיני 9,10. עם שינויים נוספים, בדיקה של הפעלת GEF בתאים subcellular אחרים יכול להיות גם אפשרי.
אנו משתמשים בשיטה הציג ללמוד הפעלת GEFs של שורות תאים אפיתל 5,6,7. עם אופטימיזציה כלשהי, assay זה צריך להיות מספיק כדי לזהות GEFs מקו כל תא. כאשר adapting לסוג תא מסוים, למצוא את מספר הנייד האופטימלי, מאגר נפח תמוגה, ואת שיטת הזיהוי של GEF להיבדק (נוגדן טוב המערבי סופג זה חשוב). על ההגדרה הראשונית של assay מומלץ להשתמש גירוי ידוע להפעיל GEF של עניין. בעת שימוש גירוי לא ידוע, תמיד להשתמש שליטה חיובית כדי לוודא assay שלך עובד. Assay זה יכול לשמש כדי לזהות הפעלת GEFs הידועים סופג המערבי. עם זאת, היא גם מספקת לזהות GEFs לא ידועים. לשם כך, GEFs שנתפסו מתוך מלאה דוגמאות מגורה יש לנתח על ג'ל Coomassie מוכתם. להקות שמופיעות רק דגימות מגורה עשוי להכיל GEFs מופעל ניתן לשלוח לזיהוי על ידי ספקטרומטריית מסה (למשל 5).
לבסוף, הערה אזהרה. Assay מבוססת על ההנחה כי שינויים posttranslational עיבוד GEFs פעילים נשמרים לאחר תמוגה התא. אכן, מדובר בבירור CASE במשך מספר GEFs, ומאז המפעלים שלה, assay זה נוצל בעבר על ידי קבוצות שונות כדי לזהות הפעלת GEFs שונים, כולל GEF-H1, p115RhoGEF ו XPLN (למשל 5,11,12,13). שימור מצב פעיל אבל לא יכול לקרות במקרה של GEFs כל, ולכן מתקבל על הדעת כי assay זה לא יעבוד עבור כל GEFs. כמו כן, יש לציין, כי GEFs רבים מפעילים פעילות לכיוון אחד או יותר GTPases קטנים. לכן, כאשר GEF ספציפית נלמדת, מומלץ להשלים את assay עם מבחני GEF משקעים עבור GTPases קטנים אחרים, כמו גם מחקרים שבחנו RhoA תפקודית, Rac1 ו Cdc42.
צעדים קריטיים פרוטוקול:
מושבות של חיידקים שהפכו יש לקח מ, צלחות טריים שהוכנו כראוי על מנת להבטיח מבחר הולם של מגבר, תוצאה תשואה טובה. שינוי תנאים של תאים המוסמכות ממקורות אחרים עשויה להשתנות ויש להתייעץ. </p>
כל השלבים של הכנת פרוטוקול חלבון (משלב 2.3) ו assay (משלב 3.2) יש לבצע על 4 מעלות צלזיוס עם פתרונות התקרר צנטריפוגות.
תמוגה חיידקי (שלב 2.5) צריך להיות יסודי ושלם על מנת לקבל השעיה הומוגנית. כאשר lysing חיידקים, מערבולת ו פיפטה lysate לסירוגין, תוך שמירה על אותו 4 ° C ולהבטיח sonication נעשה על קרח כדי למנוע denaturing חלבון. אם באמצעות מודל אחר של sonicator, תנאי ייתכן שיהיה צורך להתאים. הדגירה של sonicate עם החרוזים תמיד צריך להיעשות 4 ° C על הכתף כדי להבטיח מחייב מספיק, יש להקפיד לשמור על תזמון עקבי.
GST-Rho מוטציות אינם יציבים במידה מסוימת כאשר לידי ביטוי חיידקים, לכן עדיף להשתמש חרוזים מוכנים מיד או בתוך ימים ספורים.
Assay משקעים (חלק 3) הוא זמן רגיש טמפרטורה,מכלל GEFs פעילים יכול ללכת לאיבוד בקלות lysate התא, כך צעדים יש לבצע מהר ככל האפשר.
הסעיף הבא מכיל כמה בעיות הטיפים.
לא או כמות נמוכה מאוד של חלבון Rho מוטציה לקראת החרוז האחרון: זו עשויה להיגרם על ידי גיוס יעיל, תמוגה מספקת של חיידקים, או הפסד של החלבון בתהליך ההכנה או אחסון. כדי לסייע בפתרון חלק מן האפשרויות הללו, דגימות של חיידקים ניתן לנתח לפני ואחרי הגיוס. אם יש אינדוקציה ירודה של חלבון לחזור על התהליך באמצעות המושבה מהצלחת מפוספס טרי או טרנספורמציה מחדש תאים המוסמכות. ריכוזים IPTG שונים ושעות אינדוקציה צריך גם להיבדק. אם תמוגה אינו מספיק (כלומר חלבון נשאר גלולה במקום supernatant) משתנה מלח בריכוז חומר ניקוי במאגר תמוגה אפשר להעמיד לדין. Sonication פעמים חלופיהגדרות יש לשקול, דגימות לפני ואחרי sonication ניתן לבדוק על ידי מיקרוסקופ כדי לקבוע את היעילות של תמוגה.
לא זירז GEF, למרות GST-חלבון קיים החרוזים: זה יכול להיות בגלל בעיות טכניות במהלך assay רטיבות, או על ידי היעדר אמיתי של הפעלת GEF למד באמצעות גירוי מיושם. השתמש תמיד גירוי המכונה בקרה חיובית כדי לוודא assay שלך עובד. השתמש חרוזים מוכנים תוך מספר ימים. אם assay משקעים לוכדת כמויות לגילוי של GEF הנלמדים בכל מצב, ודא GEF שלך הוא ההווה ניתן לזהות היטב supernatant לאחר צנטריפוגה זה לשמש assay (שלב 3.3). ודא שכל מאגרים מעכבי פרוטאז טריים, ולבצע את כל הפעולות על הקרח מהר ככל האפשר. להגדיל את כמות החלבון קלט (למשל, באמצעות lysates מ 2 צלחות / לדוגמה). אם assay משקעים מראה precipi הבסיססימטרייה של GEF שלך, אבל אין הבדל בין שליטה נתפסת דגימות מגורה (איור 4), להתחיל פתרון בעיות על ידי אימות כי גירוי להחיל עבד באמצעות אפקטים ידועים אחרים (למשל על ידי איתור ההפעלה של מסלולי איתות אחרים). לשקול לשנות את תנאי הטיפול ו / או ריכוזי. להסתמך על נתוני דיווח בספרות כיצד הגירוי שלך מפעילה רו או אותות אחרים לחזות פעמים נוטים וריכוזים. כאשר אופטימיזציה של זמן טיפול, להשתמש בשתי נקודות זמן קצרות וארוכות, כמו הפעלת GEF עשוי להתגלות הטוב ביותר בנקודת הזמן לפני הפעלת Rho להבחין היטב. לבסוף, אותו גירוי יכול לגרום במידה משתנה של הפעלת עקב שינוי התגובה לתאים הנגרם מספר המעבר, תא confluency וכו '
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) (MOP-97774) ואת מדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר בקנדה (NSERC, מענק ע"נ: 480619). KS הוא חתן פרס החוקר KRESCENT חדש (פרס משותף של קרן הכליות של קנדה, קנדי נפרולוגיה חברה קנדית המכון לחקר הבריאות) לבין פרס חוקר מוקדמת ממשרד אונטריו של מחקר וחדשנות. FW נתמך על ידי מלגה לי קה שינג.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.