الطريقة المعروضة هنا يصف فحص لمتابعة تفعيل العوامل الخاصة بكل RhoA تبادل الناتج المحلي الإجمالي / GTP (GEFs) في الخلايا المزروعة، عن طريق الاستفادة من البروتين RhoA متحولة الانصهار ضريبة السلع والخدمات التي لديها قابلية عالية للGEFs تفعيلها. وعجلت GEFs من lysates الخلية، الكشف عنها بواسطة النشاف الغربية وكميا عن طريق قياس كثافة.
البروتينات للأسرة رو من GTPases الصغيرة هي المنظمين المركزية للالهيكل الخلوي، ومراقبة مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك الهجرة الخلية، والتعبير الجيني، وتقدم دورة الخلية والتصاق الخلية 1. البروتينات رو هي مفاتيح الجزيئية التي تنشط في GTP محدد وغير نشطة في الناتج المحلي الإجمالي متجهة دولة. ويتمثل الوسيط في تنشيط من قبل عائلة من البروتينات تبادل جوانين-النوكليوتيدات (GEF) عامل. رو، GEFs تشكل عائلة كبيرة، مع تداخل الخصوصيات 2. رغم إحراز الكثير من التقدم في تحديد GEFs تفعيلها من خلال اشارات معينة، لا يزال هناك العديد من الأسئلة المتبقية بشأن تنظيم مسار محدد من هذه البروتينات. عدد رو-GEFs يتجاوز 70 سنة، ويعبر عن كل خلية أكثر من مرفق البيئة العالمية من البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من هذه البروتينات بتنشيط ليس فقط رو، ولكن أعضاء آخرين في الأسرة، ويسهم في زيادة تعقيد شبكات تنظيمية. الأهم من ذلك، واستكشافكيف يتم تنظيم GEFs يتطلب طريقة لمتابعة تجمع نشط من GEFs الفردية في الخلايا تفعيلها من خلال محفزات مختلفة. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة عن الطريقة المستخدمة لتقييم وتحديد ما هو متاح نشط رو محددة GEFs باستخدام فحص الهطول تقارب. وقد تم تطوير هذا الفحص قبل بضع سنوات في المختبر بوريدج 3،4 وليس لدينا استخدامها في خطوط الكلى خلية أنبوبي 5،6،7. الفحص يستفيد من "النوكليوتيدات الحرة" RhoA متحولة، مع قابلية عالية للGEFs نشط. الطفرة (G17A) يجعل بروتين قادر على الربط الناتج المحلي الإجمالي أو GTP والدولة هذا يقلد الدولة الوسيطة التي لا بد أن مرفق البيئة العالمية. وأعرب عن نسخة ضريبة السلع والخدمات الموسومة هذا البروتين الطافر وتنقيته من E. كولاي، منضما إلى حبات sepharose و الجلوتاثيون واستخدامها ليعجل GEFs نشط من lysates من الخلايا غير المعالجة، وحفز. كما يتم تنشيط معظم GEFs عبر تعديلات posttranslational أو إطلاق سراح من الارتباطات المثبطة، دولتهم نشطيتم الاحتفاظ في lysates الخلية، ويمكن الكشف عنها بواسطة هذا الاختبار 8. ويمكن القبض على البروتينات وبحث عن GEFs معروفة من قبل اكتشاف أجسام مضادة محددة مع استخدام النشاف الغربية، أو تحليلها بواسطة الطيف الكتلي لتحديد GEFs غير معروف تفعيلها من خلال مثيرات معينة.
الطريقة المعروضة هنا هو متاح فقط فحص التنشيط غير المشعة لGEFs التي يمكن أن تتبع تجمع نشط من GEFs في الخلايا. الفحص مشابه لفحوصات هطول الأمطار تستخدم لتنشيط التالية من GTPases الصغيرة وكذلك GEFs ضد طلب وCdc42. هذه المقايسات استخدام مختلف ضريبة السلع والخدمات الموسومة البروتينات وبيننا اختلاف طفيف من واحد وصفها هنا، ولكن الخطوات الأساسية هي نفسها. وبالتالي، يمكن بسهولة هذا البروتوكول يمكن تكييفها لGTPase الصغيرة الأخرى والمقايسات تفعيل مرفق البيئة العالمية.
تعديل لمرفق البيئة العالمية مؤخرا الفحص المقدمة للتطبيق للكسور النووية 9،10. مع مزيد من التعديلات، قد اختبار تفعيل مرفق البيئة العالمية في مقصورات التحت خلوية أخرى يكون من الممكن أيضا.
نحن نستخدم طريقة عرض لدراسة تفعيل GEFs في خطوط الخلايا الظهارية 5،6،7. مع بعض التحسين، وهذا ينبغي أن تكون كافية لفحص الكشف عن GEFs من أي خط الخلية. عندما adaptiنانوغرام إلى نوع من الخلايا المحددة، والعثور على عدد الخلايا الأمثل، وتحلل حجم العازلة، وطريقة الكشف عن مرفق البيئة العالمية لفحصها (الأجسام المضادة جيدة للغرب النشاف هو المهم). من أجل الإعداد الأولي للفحص فإنه من المستحسن استخدام التحفيز ما هو معروف لتفعيل مرفق البيئة العالمية من اهتمام. عند استخدام الحوافز غير معروف، ودائما استخدام عنصر تحكم إيجابي للتحقق من أن الفحص الخاص بك يعمل. ويمكن استخدام هذا الفحص للكشف عن تفعيل GEFs معروفة من قبل النشاف الغربية. ومع ذلك، فإنه هو أيضا مناسبة للتعرف على GEFs غير معروف. لهذا، ينبغي تحليل GEFs تم الاستيلاء عليها من مراقبة وعينات حفز على مادة هلامية Coomassie الملطخة. قد العصابات التي تظهر فقط في عينات تحتوي على حفز GEFs تفعيلها، ويمكن أن ترسل لتحديد الهوية بواسطة الطيف الكتلي (على سبيل المثال 5).
وأخيرا، هناك ملاحظة تحذيرية. ويستند الفحص على افتراض أن يتم الاحتفاظ التعديلات posttranslational تقديم GEFs نشط بعد تحلل الخلية. في الواقع، وهذا هو واضح في كاليفورنياسراج الدين لعدد من GEFs، ومنذ إنشائها، وقد استخدم هذا الاختبار من قبل مختلف المجموعات للكشف عن تفعيل GEFs مختلفة، بما في ذلك مرفق البيئة العالمية-H1، p115RhoGEF وXPLN (على سبيل المثال 5،11،12،13). المحافظة على حالة نشطة لكن قد لا يحدث في حالة جميع GEFs، وبالتالي فإنه من الممكن تصور أن هذا الاختبار لن تعمل لجميع GEFs. كما أن لديها الجدير بالذكر، أن العديد من GEFs بذل نشاط نحو أكثر من واحد GTPases الصغيرة. وبالتالي، عندما يتم درس مرفق معين، فمن المستحسن لاستكمال هذا الاختبار مع المقايسات هطول الأمطار مرفق البيئة العالمية للGTPases الصغيرة الأخرى، فضلا عن الدراسات الفنية بدراسة RhoA، Rac1 وCdc42.
خطوات حاسمة في البروتوكول:
وينبغي أن ينتبه مستعمرات من البكتيريا تحول من لوحات، طازجة أعدت بشكل صحيح لضمان الاختيار الملائم من قبل أمبير، ثمرة جيدة والعائد. قد تحول الظروف للخلايا المختصة التي تم الحصول عليها من مصادر أخرى تختلف وينبغي استشارة. </p>
يجب أن يتم تنفيذ كل الخطوات من البروتين إعداد بروتوكول (من الخطوة 2.3) وفحص و(من الخطوة 3.2) في 4 درجات مئوية مع حلول تبريد وأجهزة الطرد المركزي.
وينبغي أن تحلل الجرثومي (الخطوة 2.5) تكون شاملة وكاملة من أجل الحصول على تعليق متجانسة. عندما lysing للبكتيريا، ودوامة ماصة للالمحللة بالتناوب، مع الحفاظ عليه في درجة مئوية (4) وضمان ان يتم صوتنة على الجليد لمنع تبديل طبيعة البروتين. إذا باستخدام نموذج مختلف من sonicator، قد الظروف هناك حاجة الى تعديلها. وينبغي دائما حضانة يصوتن مع حبات ينبغي القيام به في 4 درجات مئوية على محور دوار لضمان ملزم كاف، وينبغي توخي الحذر للحفاظ على توقيت ثابت.
ضريبة السلع والخدمات، رو المسوخ غير مستقرة إلى حد ما عندما أعرب في البكتيريا، ولذلك فمن الأفضل استخدام الخرز معدة على الفور أو في غضون بضعة أيام.
الفحص هطول الأمطار (الجزء 3) هو وقت حساس ودرجة الحرارة، وهوويمكن S GEFs نشط خسر بسهولة من المحللة خلية، ينبغي القيام بالخطوات ذلك في أسرع وقت ممكن.
المقطع التالي يحتوي على بعض النصائح حل المشاكل.
لا أو كمية قليلة جدا من البروتين رو متحولة في إعداد حبة النهائي: قد يكون سبب هذا الاستقراء غير فعال، تحلل كافية من البكتيريا، أو فقدان للبروتين أثناء عملية الإعداد أو التخزين. للمساعدة في استكشاف بعض من هذه الاحتمالات، يمكن تحليل عينات من البكتيريا قبل وبعد الاستقراء. إذا كان هناك تحريض الفقراء من البروتين تكرار هذه العملية باستخدام مستعمرة من لوحة يشوبه طازجة أو من إعادة تحويل خلايا المختصة. وينبغي أيضا تركيزات IPTG وأوقات مختلفة الاستقراء يتم اختبارها. ويمكن إذا ما تحلل ليست كافية (أي البروتين يبقى في بيليه بدلا من طاف) متفاوتة الملح والمنظفات تركيزات في المخزن المؤقت تحلل يحاكم. مرات صوتنة المناوبين ووينبغي النظر في الضبط، ويمكن التحقق من العينات قبل وبعد صوتنة بواسطة الفحص المجهري لتحديد كفاءة تحلل.
عجل لا مرفق البيئة العالمية، على الرغم من أن ضريبة السلع والخدمات من البروتين موجود على حبات: قد يكون هذا بسبب مشاكل تقنية خلال فحص هطول الأمطار، أو من خلال غياب حقيقي لتفعيل مرفق البيئة العالمية درست باستخدام التحفيز تطبيقها. استخدم دائما حافزا يعرف باسم مراقبة إيجابية للتحقق من أن الفحص الخاص بك يعمل. استخدام الخرز المعدة في غضون بضعة أيام. إذا كان فحص ترسيب يلتقط كميات لا يمكن اكتشافها من مرفق البيئة العالمية دراسة في جميع الأحوال، تحقق من أن مرفق البيئة العالمي الخاص موجودا وقابلا للاكتشاف بئر في طاف بعد الطرد المركزي التي يتم استخدامها لفحص (الخطوة 3.3). تأكد من أن جميع المخازن ومثبطات الأنزيم البروتيني هي جديدة، وتنفيذ كافة الخطوات على الجليد في أسرع وقت ممكن. زيادة كمية البروتين المدخلات (على سبيل المثال من خلال استخدام لوحات lysates في الفترة من 2 / عينة). إذا كان فحص ترسيب يظهر precipi القاعديةإتباع ذلك مرفق البيئة العالمية، ولكن ينظر لا فرق بين الرقابة وعينات حفز (الشكل 4)، وبدء استكشاف الأخطاء وإصلاحها من خلال التحقق من أن تطبيق حافز يعمل باستخدام غيرها من الآثار المعروفة (على سبيل المثال عن طريق الكشف عن تنشيط المسارات الأخرى مما يشير). النظر في تغيير شروط العلاج و / أو تجمعات. تعتمد على بيانات من التقارير الأدب كيفية التحفيز الخاص ينشط رو أو إشارات أخرى للتنبؤ مرات على الأرجح وتركيزات. عندما تحسين وقت العلاج، واستخدام كل نقاط زمنية قصيرة وطويلة، ومرفق البيئة العالمية التنشيط قد يكون أفضل للكشف في وقت لوقت قبل تفعيل رو اكتشاف جيد. أخيرا، يمكن أن يؤدي إلى تحفيز نفسه درجة مختلفة من التنشيط بسبب تغيير في استجابة الخلية الناجمة عن عدد مرور، خلية confluency، الخ.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) (MOP-97774)، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC، ومنحة NR: 480619). كانساس هو حاصل على جائزة محقق جديد KRESCENT (جائزة مشتركة لمؤسسة الكلى من كندا، والكندي جمعية أمراض الكلى والمعهد الكندي للبحوث الصحية)، وجائزة الباحث في وقت مبكر من وزارة أونتاريو للبحوث والابتكار. معتمد من قبل مهاجم شينغ لي كا منحة دراسية.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
pGEX-RhoA(G17A) | Addgene | Will be available soon | Generated in the lab of Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) |
DH5α | Invitrogen | 18258-012 | Store -80°C |
SOC medium | BioShop | SOC001.10 | |
LB | BioShop | LBL407.1 | Keep sterile |
Glycerol | BioShop | GLY002.1 | |
Ampicillin | BioShop | AMP201.25 | Store stock at -20°C |
Agar | BioShop | AGR001.500 | |
IPTG ( Isopropyl B-D-thiogalacto-pyranoside) | Calbio-chem | 420322 | Store stock solution at -20°C |
Glutathione Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
PBS 10x | SIGMA | D1408 | |
Hepes | SIGMA | H4034 | |
NaCl | BioShop | SOD001.10 | |
MgCl2 | SIGMA | M-9272 | Add just before use |
TX-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
DTT | OmniPur EMD | 3860 | Add just before use |
PMSF | SIGMA | P-7626 | Add just before use |
Protease Inhibitor 50x | BD Baculo-Gold | 51-21426Z | Add just before use |
Complete Mini, EDTA-free 10x | Roche | 11 836 170 001 | Add just before use |
Laemmli Sample Buffer 2x | Bio-Rad | 161-0737 | |
β-mercaptoethanol | SIGMA | M7154 | Add just before use |
Coomassie Brilliant Blue | Bio-Rad | R-250 | |
Acetic Acid | CALEDON | 1000-1 | |
Methanol | CALEDON | 6701-7 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0114 | |
BLUeye ladder | FroggaBio | PM008-0500 |
Table 1. Reagents used.
Name of equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
RC-5B centrifuge | Sorvall | SS-34 Rotor | Use at 4°C |
Centrifuge | Sorvall-Thermo Scientific | ST-16R | Use at 4°C |
Micro centrifuge | Eppendorf | 5417R | Use at 4°C |
Bacterial shaker | INFORS HT Ecotron | AG CH-1403 Bottmingen | Use at 37°C or at 22°C |
Sonicator | Branson | Sonifier-450 | Use at RT |
Rotator | Glas-Col | 099A CR4012 | Use at 4°C |
Table 2. Specific equipments used.