Croci sessuali e isolamento della progenie ricombinante sono strumenti di ricerca importanti per il fungo filamentoso,<em> Fusarium graminearum</em>, Le tecniche necessarie successo svolgere questi processi sono presentati.
Fusarium graminearum è diventato un sistema modello per gli studi nello sviluppo e la patogenicità dei funghi filamentosi. F. graminearum più facilmente produce corpi fruttiferi, detti periteci, su agar carota. Periteci contengono numerosi tipi di tessuti, prodotti in determinate fasi dello sviluppo perithecium. Questi includono (in ordine di apparizione) formazione delle iniziali perithecium (che dà luogo a ife ascogenous), il muro esterno, paraphyses (miceli sterili che occupano il centro della perithecium fino al ASCI sviluppo), l'ASCI, e le ascospore all'interno aschi 14. Lo sviluppo di ciascuno di questi tessuti è separato da circa 24 ore ed è stata la base di studi trascrittomica durante lo sviluppo sessuale 12,8. Fare riferimento alla Hallen et al. (2007) per una descrizione più approfondita di sviluppo, comprese le fotografie di ogni tappa. Qui vi presentiamo i metodi per la generazione e la raccolta sincronamente lo sviluppo di prati di periteci per gli studi temporali di regolazione genica, sviluppo e processi fisiologici. Sebbene questi metodi sono scritti specificamente per essere utilizzato con F. graminearum, le tecniche possono essere utilizzate per una varietà di altri funghi, purché fruttificazione può essere indotta in coltura e vi è una certa sincronia di sviluppo. Di recente abbiamo adattato questo protocollo per studiare lo sviluppo sessuale di F. verticillioides. Anche se periteci individuo deve essere raccolte a mano in questa specie, a causa di un prato in via di sviluppo periteci non poteva essere indotta, il processo ha funzionato bene per lo studio dello sviluppo (Sikhakolli e Trail, inedito).
La funzione più importante di corpi fruttiferi fungini è la dispersione delle spore. In molte delle specie di Ascomycota (asco produrre funghi), spore vengono sparati da asco, a causa della generazione di pressione all'interno del turgore asco, guida espulsione di spore (e fluido epiplasmic) attraverso l'pori nella punta asco 2,7. I nostri studi di scarico forzato ascospore hanno portato allo sviluppo di un "test di scarico spore", che usiamo per lo screening di mutazioni nel processo. Qui vi presentiamo i dettagli di questo test.
F. graminearum è homothallic, e quindi possono formare corpi fruttiferi in assenza di un partner compatibile. Il vantaggio di homothallism è che la traversata non è necessario generare prole omozigote per un carattere particolare, un aspetto che ha facilitato lo studio dello sviluppo sessuale in questa specie 14,7. Tuttavia, heterothallic ceppi sono stati generati che possono essere utilizzati per l'attraversamento 5,9. È anche possibile attraversare ceppi homothallic ottenere mutanti dei geni diversi in un unico ceppo 1. Questo viene fatto coinoculating un piatto Petri con 2 ceppi. Lungo il punto di incontro, la maggioranza dei periteci sarà ricombinante (fornita una mutazione in uno dei ceppi madri non inibisceincroci). Con l'età periteci, trasudano ascospore in massa, invece di forza li scarica. L'essudato spore risultante (chiamato cirrhus) si trova sulla punta del perithecium e può essere facilmente rimossa per il recupero di spore individuali. Qui vi presentiamo un protocollo per facilitare l'identificazione dei periteci ricombinante e il recupero della progenie ricombinante.
F. graminearum è particolarmente adatto per lo studio di sviluppo fruttificazione corpo grazie alla disponibilità di una ben annotato genoma ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / , 4), e la disponibilità di un Affymetrix, basato microarray 6. Questo ha facilitato la capacità di identificare i geni importanti per lo scarico ascospore 7,11,3. I metodi qui presentati permetteranno al ricercatore di concentrarsi su un insieme discreto di stadi di sviluppo e le funzioni per l'analisi genetica dei corpi fruttiferi di F. graminearum. I metodi sono inoltre facilmente adattabili a funghi correlati che possono essere indotte a frutta in coltura, e può essere utilizzato come standard per lo sviluppo in una varietà di tipi fruttiferi altri fungine corpo.
La capacità di valutare un fenotipo spore di cottura può essere sottile nelle specie in cui spore sono piccole e difficili da vedere, come <em> F. graminearum. La raccolta di spore su un vetrino pulito facilita sia la valutazione visiva, e la valutazione quantitativa, in quanto le spore possono essere lavati dal vetrino e quantificato. Alcune specie fungine producono una mucillagine che circonda la loro spore e le spore non possono essere risciacquata, ma devono essere contati al microscopio che restano sulla slitta. Abbiamo trovato che questo è vero di Sclerotinia sclerotiorum.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation (MCB-0.923.794 a FT).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center, Kansas | FGSC 9075 |
Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 |
Czapek’s Dox Agar | Difco, Becton Dickinson | 233810 |
Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |