Un test di screening a fluorescenza per l'identificazione di modulatori Canali GIRK

Summary

A real-time procedura di screening per identificare i farmaci che interagiscono con la proteina G-gated verso l'interno raddrizzatore K⁺ (GIRK) canali viene descritto. Il test utilizza coloranti fluorescenti potenziale di membrana sensibili per misurare l'attività dei canali GIRK. Questa tecnica è adattabile per l'uso su un certo numero di linee cellulari.

Abstract

Proteina G-dipendenti verso l'interno del raddrizzatore K ⁺ (GIRK) canali di agire come mediatori cellulari di una vasta gamma di ormoni e neurotrasmettitori e sono espressi nel cervello, cuore, muscolo scheletrico e del tessuto endocrino ^1,2. GIRK canali si attivano in seguito il legame di ligandi (ormoni, neurotrasmettitori, farmaci, ecc) per la loro membrana plasmatica-bound, accoppiati a proteine ​​G recettori (GPCR). Tale legame determina la stimolazione delle proteine ​​G (G e G _{o i)} che legano e successivamente attivare il canale GIRK. Una volta aperto il canale GIRK consente il movimento di K ⁺ fuori dalla cellula causando la membrana riposo potenziale di diventare più negativo. Di conseguenza, canale attivazione GIRK in neuroni diminuisce formazione spontanea potenziale di azione e inibisce il rilascio di neurotrasmettitori eccitatori. Nel cuore, l'attivazione del canale GIRK inibisce l'attività del pacemaker così rallentando la frequenza cardiaca.

<pclass = ""> jove_content canali GIRK rappresentano nuovi bersagli per lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici per il trattamento del dolore neuropatico, tossicodipendenza, aritmie cardiache e altri disturbi ^3. Tuttavia, la farmacologia di questi canali rimane in gran parte inesplorato. Sebbene un certo numero di farmaci anti-aritmici tra cui agenti, i farmaci antipsicotici e antidepressivi bloccare il canale GIRK, questa inibizione non è selettiva e si verifica a concentrazioni relativamente elevate di droga ^3.

Qui, noi descriviamo un tempo reale saggio di screening per identificare modulatori di nuovi canali GIRK. In questo saggio, cellule neuronali AtT20, che esprimono canali GIRK, vengono caricati con membrana coloranti fluorescenti sensibili potenziale come bis-(1,3-dibutylbarbituric acido) trimethine oxonol [DiBAC ₄ (3)] o HLB 021-152 (Figura 1 ). Le molecole di colorante fluorescente diventano fortemente seguente captazione nelle cellule (Figura 1). Trattamentodelle cellule con leganti GPCR stimola i canali GIRK per aprire. La risultante K ⁺ efflusso fuori dalla cellula causa del potenziale di membrana a diventare più negativo e il segnale fluorescente per diminuire (Figura 1). Pertanto, i farmaci che modulano K ⁺ efflusso attraverso il canale GIRK può essere saggiata usando un lettore di piastra fluorescente. A differenza di altri saggi di screening dei canali ionici, quali spettrometria di assorbimento atomico o ⁴ radiotracciante analisi ^5, il saggio GIRK canale fluorescente fornisce una procedura di screening rapido, in tempo reale e poco costoso.

Protocol

1. Preparazione delle cellule Grow pituitari AtT20 cellule in terreno Dulbecco modificato Eagle (DMEM) supplementato con siero di cavallo 10% e mantenere colture a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2. Mantenere la cultura Trapianto delle cellule ogni 5 a 7 giorni utilizzando una procedura standard tripsinizzazione. Coat i pozzi di nero, fondo chiaro, piastre a 96 pozzetti con 50 pl di poli-L-lisina. Lasciare asciugare i pozzetti per 30 minuti in incubatrice. Pi…

Discussion

Mentre il potenziale di membrana coloranti fluorescenti sensibili sono stati utilizzati per identificare i farmaci che modulano i canali ionici ^9,10, questo è il primo rapporto della loro applicazione per la scoperta di farmaci neuronale GIRK canale. Il saggio GIRK canale fluorescente qui presentato fornisce un metodo rapido, affidabile e in tempo reale per lo screening del ligando-dipendenti canali del K ^+. Il dosaggio può essere modificato per l'utilizzo con un'ampia gamma di cellule, c…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM	CellGro	10-013
Horse serum	Invitrogen	16050-114
96-well plates	Corning	3603
Poly-l-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
Somatostatin	Sigma-Aldrich	S9129
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382
HLB 021-152	AnaSpec	89300
Versette automated liquid handler	ThermoFisher	650-01
Synergy2 fluorescent plate reader	Biotek
Gen5 analysis software	Biotek

Table 1. Table of specific reagents and equipment.