Een real-time screening procedure voor het identificeren van geneesmiddelen die een interactie met G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter K<sup> +</sup> (GIRK) kanalen beschreven. De test maakt gebruik van membraanpotentiaal-gevoelige fluorescente kleurstoffen op GIRK activiteit op het kanaal te meten. Deze techniek is geschikt voor toepassing op een aantal cellijnen.
G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter K + (GIRK) kanalen functioneren als cellulaire mediatoren van een breed scala van hormonen en neurotransmitters en worden uitgedrukt in de hersenen, het hart, de skeletspieren en endocriene weefsel 1,2. GIRK kanalen worden geactiveerd na de binding van liganden (neurotransmitters, hormonen, drugs, enz.) om hun plasma-membraan-gebonden, G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's). Deze binding veroorzaakt de stimulatie van G-eiwitten (G i G en o), dat vervolgens binden en activeren GIRK kanaal. Eenmaal geopend de GIRK kanaal maakt het mogelijk de beweging van K + uit de cel, waardoor de rust membraanpotentiaal om meer negatief. Bijgevolg GIRK kanaal activering in neuronen afneemt spontane vorming van actiepotentiaal en remt de afgifte van neurotransmittoren. In het hart, de activering van de GIRK kanaal remt pacemaker-activiteit waardoor het vertragen van de hartslag.
<pclass = "jove_content"> GIRK kanalen vormen nieuwe targets voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen voor de behandeling neuropathische pijn, drugsverslaving, hartritmestoornissen en andere aandoeningen 3. Echter, de farmacologie van deze kanalen nog grotendeels onontgonnen. Hoewel een aantal geneesmiddelen, waaronder anti-aritmische middelen, antipsychotica en antidepressiva blokkeren de GIRK kanaal, deze remming is niet selectief en komt voor bij relatief hoge concentraties van de stof 3.We beschrijven hier een real-time screening test voor het identificeren van nieuwe modulatoren van GIRK kanalen. In deze assay worden neuronale AtT20 cellen tot expressie GIRK kanalen geladen membraan potentiaal gevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals bis-(1,3-dibutylbarbituric zuur) trimethine-oxonol [DiBAC 4 (3)] of HLB 021-152 (figuur 1 ). De kleurstofmoleculen wordt sterk fluorescerend volgende opname in de cellen (Figuur 1). Behandelingvan de cellen met GPCR liganden stimuleert GIRK kanalen te openen. De resulterende K + efflux de cel veroorzaakt het membraan mogelijk om meer negatieve en het fluorescentiesignaal dalen (figuur 1). Zo kunnen medicijnen die K + efflux moduleren door het GIRK kanaal worden getest met behulp van een fluorescerende plaat lezer. In tegenstelling tot andere ionkanaal screeningstesten, zoals atomaire absorptiespectrometrie 4 of radiotracer analyse 5, de GIRK kanaal fluorescentie biedt een snelle, real-time en goedkope screening procedure.
Terwijl de membraanpotentiaal-gevoelige fluorescente kleurstoffen zijn gebruikt om medicijnen die ionkanalen moduleren 9,10 te identificeren, dit is het eerste verslag van hun aanvraag voor neuronale GIRK kanaal drug discovery. De GIRK kanaal fluorescentie hier gepresenteerde biedt een snelle, betrouwbare en real-time methode voor de screening van ligand-gated K + kanalen. De test kan worden aangepast voor gebruik met een groot aantal cellen inclusief geïmmortaliseerde cellijnen (HEK293, CHO, enz….
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de US Public Health Service Award NS-071530.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
DMEM | CellGro | 10-013 |
Horse serum | Invitrogen | 16050-114 |
96-well plates | Corning | 3603 |
Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 |
Somatostatin | Sigma-Aldrich | S9129 |
Carbachol | Sigma-Aldrich | C4382 |
HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 |
Versette automated liquid handler | ThermoFisher | 650-01 |
Synergy2 fluorescent plate reader | Biotek | |
Gen5 analysis software | Biotek |
Table 1. Table of specific reagents and equipment.