Summary

התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני

Published: April 09, 2012
doi:

Summary

זנים מסוימים עכבר מסוגלים לעמוד בפני גיוס של Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE) עם חלבון המיאלין הבסיסי. המתואר כאן הוא פרוטוקול חיסון פשוט הופך את חוסר התגובה וגורם למחלת שיתוק בכמה כתמים אופייניים EAE עכבר עמידים.

Abstract

Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE) היא מחלה דלקתית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) וכן שימש במודל חיה למחקר של המחלה demyelinating האדם, טרשת נפוצה (MS). EAE מתאפיין בחדירה פתולוגית של תאים mononuclear לתוך מערכת העצבים המרכזית ועל ידי הביטוי הקליני של מחלת שיתוק. בדומה MS, EAE גם תחת שליטה גנטית כי זנים מסוימים עכבר רגישים אינדוקציה המחלה בעוד אחרים עמידים. בדרך כלל, C57BL / 6 (H-2 ב) לחסן עכברים עם חלבון המיאלין הבסיסי (MBP) אינם מפתחים סימני שיתוק. חוסר תגובה זה בהחלט לא בשל פגמים עיבוד אנטיגן או מצגת אנטיגן של MBP, כמו פרוטוקול הניסוי המתואר כאן נעשה שימוש כדי לגרום EAE חמורה C57BL / 6 עכברים, כמו גם זנים אחרים נחשב עכבר עמידים. בנוסף, encephalitogenic שיבוטים תא ה-T של C57BL / 6 ו Balb / C עכברים תגובתי ל MBP היה הצלחהמבודד לחלוטין מופצות.

פרוטוקול הניסוי כולל באמצעות המערכת הסלולרית העברת המאמץ שבו MBP-דרוך (200 מיקרוגרם / עכבר) C57BL / 6 לימפה הצומת התורמות תאים מבודדים ותרבותית במשך חמישה ימים עם אנטיגן כדי להרחיב את מאגר MBP ספציפית בתאי T. בסוף התקופה תרבות, 50 מיליון תאים קיימא מועברים לנמענים syngeneic תמימים דרך וריד הזנב. העכברים שטופלו כך נמענים בדרך כלל אינם מפתחים EAE, ובכך מאשרים מחדש מצב עמיד שלהם, והם יכולים להישאר נורמלי ללא הגבלת זמן. עשרה ימים בתא העברת הודעה, עכברים הנמען מאותגרים עם שלמה פרוינד אדג'ובנטי (CFA), תחליב MBP בארבעה אתרים האגפים. EAE חמורה מתחילה להתפתח אצל עכברים אלו עשר עד 14 ימים לאחר האתגר. תוצאות המחקר הראו כי אינדוקציה של המחלה היה ספציפי אנטיגני כאתגר עם אנטיגנים לא רלוונטיות לא לגרום סימנים קליניים של המחלה. באופן משמעותי, טיטרציה של מינון האנטיגן פעםתיגר על עכברים הראו כי הנמען הוא יכול להיות נמוך כמו 5 מיקרוגרם / עכבר. בנוסף, המחקר הקינטית של עיתוי אתגר אנטיגני עולה כי האתגר לגרום למחלה היה יעיל כבר 5 ימים האתגר הודעה אנטיגני וכל עוד מעל 445 האתגר ימים אנטיגני הודעה. נתונים אלה מאוד נקודת למעורבות של האוכלוסייה "חיים ארוכים" תא T בשמירה על חוסר תגובה. מעורבותם של תאים T רגולטוריים (Tregs) במערכת זו אינו מוגדר.

Protocol

1. הכנת CFA-תחליב Antigen ממיסים חזיר ים MBP (מוכן לפי השיטה של ​​Swanborg1 ומאוחסנים בצורה lyophilized ב 4 ° C) בתמיסה פוספט חיץ (PBS) בריכוז של 2 מ"ג / מ"ל. אם פפטידים MBP מסונתז (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) 2 משמשים, להכין פתרון 2 מ"ג /…

Discussion

מחקרים של EAE בעכברים לעתים קרובות לנצל את neuroantigens, חלבון המיאלין הבסיסי (MBP), חלבון proteolipid (PLP) או חלבון המיאלין oligodendrocyte (ש"א). מחקרים קודמים השתמשו בעיקר MBP. PLP מעורר תגובות חזקות ועקביות מעכברים SJL. לאחרונה, ש"א הוא neuroantigen הנפוצות כי בי -6 עכברים רגישים למחלות אינדוקצי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

נתמך בחלקו על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (R01 NS37253 ו N01 NS055167) והחברה הלאומית טרשת נפוצה (RG 3288-A6).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Guinea pig spinal cords Rockland Immuno-chemicals, Inc.
Gilbertsville, PA 19525
www.rockland-inc.com
GP-T065 frozen
Freund’s Adjuvant, complete H37Ra Difco Laboratories
Detroit, MI
231131
Multifit interchange-able syringe B-D
www.bd.com/us
512133
RPMI 1640 Mediatech Inc.
Manassas, VA
www.cellgro.com
10-040-CM
OVA Sigma-Aldrich
www.sigmaaldrich.com
A5503
Mice Jackson Laboratory
Bar Harbor, Maine
B6 mice: 0000664

References

  1. Swanborg, R. H., Sabato, G. D. Experimental allergic encephalomyelitis. Methods in Enzymology. 162, 413-421 (1988).
  2. Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F., Tse, H. Y. Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: Mapping of T cell epitopes and T cell Vb gene segment usage. J. Neuroscience Research. 45, 690-699 (1996).
  3. McCarron, R., McFarlin, D. E. Adoptively transferred experimental autoimmune encephalomyelitis in SJL/J, PL/J, and (SJL/J x PL/J)F1 mice. Influence of I-A haplotypes on encephalitogenic epitope of myelin basic protein. J. Immunol. 141, 1143-1149 (1988).
  4. Shaw, M. K., Kim, C., Ho, K. -. L., Lisak, R. P., Tse, H. Y. A combination of adoptive transfer and antigenic challenge induces consistent murine experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice and other reputed resistant strains. J. Neuroimmunol. 39, 139-150 (1993).
  5. Krishnamoorthy, G., Saxena, A., Mars, L. T., Domingues, H. S., Mentele, R., Ben-Nun, A., Lassmann, H., Dornmair, K., Kurschus, F. C., Liblau, R. S., Wekerle, H. Myelin-specific T cells also recognize neuronal autoantigen in a transgenic mouse model of multiple sclerosis. Nat. Med. 15, 626-632 (2009).
  6. Anderson, A. C., Reddy, J., Nazareno, R., Sobel, R. A., Nicholson, L. B., Kuchroo, V. K. IL-10 plays an important role in the homeostatic regulation of the autoreactive reperteroire in naïve mice. J. Immunol. 173, 828-834 (2004).
  7. Anderton, S. M. Treg and T-effector cells in autoimmune CNS inflammation: a delicate balance easily disturbed. Eur. J. Immunol. 40, 332-334 (2010).
  8. Arnon, R. Experimental allergic encephalomyelitis – susceptibility and suppression. Immunol. Rev. 55, 5 (1981).
  9. Billiau, A., Heremans, H., Vandekerckhove, F., Dijkmans, R., Sobis, H., Meulepas, E., Carton, H. Enhancement of experimental allergic encephalomyelitis in mice by antibodies against IFN-g. J. Immunol. 140, 1506-1510 (1988).
  10. Arbomson-Leeman, S., Alexander, J., Bronson, R., Corroll, J., Southwood, S., Dorf, M. Experimental autoimmune encephalomyelitis-resistant mice have highly encephalitogenic myelin basic protein (MBP)-specific T cell clones that recognize a MBP peptide with high affinity for MHC class II. J. Immunol. 154, 388-398 (1995).
  11. Reddy, J., Illes, Z., Zhang, X., Encinas, J., Nicholson, L., Sobel, R. A., Wucherpfennig, K. W., Kuchroo, V. K. Myelin proteolipid protein-specific CD4+CD25+ regulatory cells mediate genetic resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15434-15439 (2004).
  12. Korn, T., Reddy, J., Gao, W., Bettelli, E., Awasthi, A., Petersen, T. R., Backstrom, B. T. Myelin- specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation. Nature Med. 13, 423-431 (2007).
  13. Shaw, M. K., Li, J., Ho, P. P., Hao, H., Lisak, R. P., Tse, H. Y., Broglie, P. V. Induction of myelin basic protein-specific adoptive experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice. Longevity of donor T cells and lack of disease relapses. Neuroimmunology Research Focus. , 175-191 (2007).

Play Video

Cite This Article
Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge. J. Vis. Exp. (62), e3778, doi:10.3791/3778 (2012).

View Video