El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

Summary

Este protocolo de vídeo demuestra un método novedoso para la generación y la posterior purificación de las células progenitoras neuronales de una fuente renovable de células madre neurales (NSC) en base a su físico (granularidad tamaño e interna) y las propiedades fluorescentes utilizando la tecnología de citometría de flujo.

Abstract

Las células madre neurales (NSC) puede aislarse y ampliado en gran escala, utilizando el ensayo neuroesfera y diferenciado en los tres tipos principales de células del sistema nervioso central (SNC), a saber, los astrocitos, oligodendrocitos y neuronas. Estas características hacen de madre neurales y las células progenitoras de una valiosa fuente renovable de células para estudios in vitro, tales como la detección de drogas, neurotoxicología y electrofisiología y también para la terapia de reemplazo celular en muchas enfermedades neurológicas. En la práctica, sin embargo, la heterogeneidad de la progenie Consejo de Seguridad Nacional, la baja producción de neuronas y oligodendrocitos, y el predominio de los astrocitos después de la diferenciación limitan sus aplicaciones clínicas. Aquí se describe una nueva metodología para la purificación de la generación y posterior de las neuronas inmaduras de la progenie NSC murino utilizando fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de tecnología. Utilizando esta metodología, una población neuronal altamente enriquecido de células progenitoras se puede lograr el ingenioHout cualquier astrocito y la contaminación notable de buena fe Consejo de Seguridad Nacional. El procedimiento incluye la diferenciación de la progenie NSC aislaron y expandieron desde E14 eminencias ratón ganglionares utilizando el ensayo neuroesfera, seguido por aislamiento y enriquecimiento de las células neuronales inmaduras en base a sus propiedades físicas (tamaño y complejidad interna) y fluorescente utilizando la tecnología de citometría de flujo. En general, se tarda 5-7 días para generar neuroesferas y los días 6-8 de diferenciar la progenie Consejo de Seguridad Nacional y aislar altamente purificado las células neuronales inmaduras.

Protocol

1. Configuración básica Antes de proceder a la cultura de la célula NeuroCult Medio Basal y NSC NeuroCult Suplementos NSC proliferación se mezclan en una proporción 9:1, respectivamente, para hacer medio completo NSC. Un baño de agua 37 ° C se utiliza para calentar el medio. Cantidad apropiada de calor inactiva suero fetal bovino (FCS) se descongela. Cantidad apropiada de las soluciones madre de factor de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento epidérmico (EGF a …

Discussion

La capacidad de aislar las poblaciones definidas de células neuronales (neuronas, es decir, astrocitos y oligodendrocitos) podría resolver algunos de los impedimentos asociados con la aplicación clínica de células madre neurales (NSC). En primer lugar, nos permite caracterizar completamente la población a partir de las células del donante. En segundo lugar, nos permite utilizar un tipo de célula particular, o una combinación de diferentes tipos de células con una proporción específica, dependiendo de la natu…

Materials

Name of the reagent	Type	Company	Catalogue number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05    trypsin-EDTA	Reagent	Gibco	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma	T6522
Pen/Strep	Reagent	Gibco	15140-122
*MEM	Reagent	Gibco	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	Gibco	15230-147
Cell strainer	Sieve	BD Falcon	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352070
EGF	Growth factor	R&D	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma	H4784	Reconstituted in PBS
Anti-PSA-NCAM-PE	Antibody	Miltenyi Biotec	130-093-274
PE- Conjugated mouse IgG1	Isotype control antibody	BD Pharminogen	556029
Heparin	Growth factor	Sigma	H4784	Reconstituted in PBS
HrBMP-4	Growth factor	R&D	314-BP-010
Poly-L-Ornithine	Reagent	Sigma	P4957
Fetal Calf Serum	Medium Supplement	Gibco	10099-141
GFAP	Antibody	DAKO	Z0334
B-III tubulin	Antibody	Promega	G7121

*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.