Summary

Le test neuroblaste: Un test pour la génération et l'enrichissement des cellules souches neuronales à partir de différenciation des cellules souches neurales Progeny Par cytométrie en flux

Published: April 22, 2012
doi:

Summary

Ce protocole vidéo démontre une nouvelle méthode pour la génération et la purification ultérieure des cellules progénitrices neuronales à partir d'une source renouvelable de cellules souches neurales (CSN) en fonction de leur physique (taille et granularité interne) et les propriétés fluorescentes en utilisant la technologie de cytométrie en flux.

Abstract

Les cellules souches neurales (CSN) peuvent être isolés et élargi à grande échelle, en utilisant le test neurosphères et différenciés dans les trois principaux types de cellules du système nerveux central (SNC); à savoir, les astrocytes, oligodendrocytes et des neurones. Ces caractéristiques font de souches neurales et les cellules progénitrices une source inestimable renouvelable de cellules pour des études in vitro, tels que le dépistage des drogues, neurotoxicologie et l'électrophysiologie et aussi pour la thérapie de remplacement cellulaire dans de nombreuses maladies neurologiques. En pratique, cependant, l'hétérogénéité de la descendance NSC, la faible production de neurones et des oligodendrocytes, les astrocytes et la prédominance de la suite de différenciation limiter leurs applications cliniques. Ici, nous décrivons une nouvelle méthodologie pour la purification de production et subséquente des neurones immatures de NSC descendance murin utilisant la fluorescence tri cellulaire (FACS) de la technologie. En utilisant cette méthodologie, une population hautement enrichi de cellules souches neuronales peuvent être atteints d'espritHout toute astrocytes notable et de bonne foi la contamination NSC. La procédure comprend la différenciation des produits de filiation du NSC isolé et agrandi à partir de E14 éminences ganglionnaires de souris en utilisant le test neurosphères, suivie par l'isolement et l'enrichissement de cellules immatures neuronaux en fonction de leurs propriétés physiques (taille et la complexité interne) et fluorescente utilisant la technologie de cytométrie en flux. Dans l'ensemble, cela prend 5-7 jours pour générer neurosphères et 6-8 jours pour différencier descendance NSC et d'isoler hautement purifié des cellules neuronales immatures.

Protocol

1. Basic Set Up Avant de procéder à la culture cellulaire NeuroCult NSC milieu de base et les suppléments NeuroCult NSC prolifération sont mélangés à un rapport 9:1, respectivement, de faire du milieu complet NSC. Un bain à 37 ° C est utilisée pour réchauffer le milieu. Quantité appropriée de inactivé par la chaleur sérum de veau foetal (FCS) est décongelé. Quantité appropriée de solutions d'achat d'actions du facteur de croissance, y compris le facteur…

Discussion

La capacité d'isoler des populations définies de cellules neurales (neurones à savoir, astrocytes et oligodendrocytes) pourrait résoudre certains des obstacles associés à l'application clinique des cellules souches neurales (CSN). Tout d'abord, il nous permet de caractériser complètement la population de départ de cellules du donneur. Deuxièmement, il nous permet d'utiliser un type cellulaire particulier ou une combinaison de différents types de cellules avec un rapport spécifique, en fonctio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le financement de la Fondation Overstreet.

Materials

Name of the reagent Type Company Catalogue number Comments
NeuroCult NSC Basal Medium Medium Stem Cell Technologies 05700  
NeuroCult NSC Proliferation Supplements Medium supplement Stem Cell Technologies 05701  
%0.05    trypsin-EDTA Reagent Gibco 25300-062  
Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma T6522  
Pen/Strep Reagent Gibco 15140-122  
*MEM Reagent Gibco 41500-018 HEM component
*HEPES Reagent Sigma H4034 HEM component
*Distilled water Reagent Gibco 15230-147  
Cell strainer Sieve BD Falcon 352340  
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196  
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905  
15 ml tubes Culture ware BD Falcon 352096  
50 ml tubes Culture ware BD Falcon 352070  
EGF Growth factor R&D 2028-EG  
b-FGF Growth factor R&D 3139-FB  
Heparin Growth factor Sigma H4784 Reconstituted in PBS
Anti-PSA-NCAM-PE Antibody Miltenyi Biotec 130-093-274  
PE- Conjugated mouse IgG1 Isotype control antibody BD Pharminogen 556029  
Heparin Growth factor Sigma H4784 Reconstituted in PBS
HrBMP-4 Growth factor R&D 314-BP-010  
Poly-L-Ornithine Reagent Sigma P4957  
Fetal Calf Serum Medium Supplement Gibco 10099-141  
GFAP Antibody DAKO Z0334  
B-III tubulin Antibody Promega G7121  

*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.

References

  1. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
  3. Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
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  6. Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).

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Cite This Article
Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (62), e3712, doi:10.3791/3712 (2012).

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