Summary

のサンプル調製<em>結核菌</em核磁気共鳴代謝研究のための>抽出

Published: September 03, 2012
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Summary

のメタボロームプロファイル<em>結核菌</em>ブロス培養で成長した後に決定されています。条件は、この微生物の代謝プロファイルに栄養補助剤、酸化剤、抗結核剤の効果をテストするために変化させることができる。抽出物調製のための手順は、1Dの両方に適用されます<sup> 1</sup> Hと2D<sup> 1</sup> H-<sup> 13</sup> C NMR分析。

Abstract

結核菌は、地球規模での人間の死亡率の主要な原因である。両方のマルチ(MDR)と広範囲に(XDR)の薬剤耐性株の出現は、現在の疾病制御の努力を脱線させると脅している。したがって、現時点で入手可能なものよりも有効である薬やワクチンの開発が急務とされている。 Mのゲノム結核は、10年以上のために知られて、まだ遺伝子の機能と本質に関する我々の知識の重要なギャップがあるされています。多くの研究では、以来、遺伝子発現の全体的なパターンに対する薬剤、酸化剤、および増殖条件の影響を決定するためにトランスクリプトームとプロテオームの両方のレベルで遺伝子発現解析を用いてきた。最終的に、これらの変更の最終的な応答は、数千の小さな分子量の化学物質を含む細菌の代謝物に反映されています。未処理またはTRか、野生型と変異株の代謝プロファイルを比較特定の薬物とeated、効果的にターゲットの識別を可能にすることができ、抗結核活性を持つ新規阻害剤の開発につながる可能性があります。同様に、メタボローム上の2つ以上の条件の影響も評価することができる。核磁気共鳴(NMR)は代謝中間体を同定し、定量化するために使用される強力な技術です。このプロトコルでは、Mの準備のための手順NMRメタボローム解析のための結核の細胞抽出物が記載されている。代謝物の保全を最大にするために低温を維持しながら、細胞培養物は、適切な条件と必要な生物学的安全性レベル3封じ込め、1収穫の下で栽培され、機械的な溶解に供される。細胞溶解物を回収し、滅菌濾過し、超低温で保存されています。これらの細胞抽出物からのアリコートを、生細胞の有無を確認するためのコロニー形成単位のためのミドル7H9寒天上にメッキが施されています。 37℃でのインキュベーションの際に二ヶ月℃、無viの場合できるコロニーが観察され、サンプルが下流の処理のための封じ込め施設から削除されます。抽出物は、凍結乾燥重水素化緩衝液に再懸濁し、その後統計的分析に供されている分光データをキャプチャし、NMR装置に注入される。説明する手順は、1次元(1D)1 H NMRおよび2次元(2D)の1 H-13 C NMR分析の両方に適用することができます。この方法論は、クロマトグラフ法よりも信頼性の高い低分子量代謝物の同定と細胞抽出物の代謝物のより信頼性が高く、敏感な定量的な分析を提供しています。細胞溶解工程の後に記載された手順のバリエーションも平行プロテオーム解析に適合させることができる。

Protocol

1。プロトコルテキストこのプロトコルは、MにNMRの方法論の適応を強調結核 (クラスIIIエージェント)。 M.を行う際にそのため、生物学的安全性レベル3(BSL3)プラクティスが従う必要があります毎年認定された研究室での結核研究。実験室で生成されたエアロゾルへの暴露では、これらの微生物を扱う担当者が直面する最も重要な危険?…

Discussion

研究のかなりの数がMのトランスクリプトームとプロテオームのプロファイルを分析してきたin vitroおよび in vivo条件下の様々な環境下で結核 。11月16日最終的には、遺伝子発現と酵素活性の変化は、小分子量の分子の濃度の変動につながる。これらの化合物の完全な説明は、メタボロームを構成している。このように、代謝経路に薬や様々な成長条件の影?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、プロトコルを開発しながら有益なコメントを博士バルレッタ博士とパワーズの研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。我々は、原稿の役立つ議論と校正のためにウェンディオースティンに感謝します。本稿で説明する作業は、ネブラスカ州リンカーンレドックス生物学センター(親助成#NCRR 2P20RR 017675、D.ベッカー、PI)の大学から上記の各調査官にシードパイロット補助金によって賄われていた。加えて、我々は研究を供給し、このパブリケーションに含まNMR法を標準化するために、氏Halouskaの部分的な給与のサポートのために彼女のR21を助成(1R21AI087561-01A1)から資金を提供するための博士OFELIAチャコンに感謝します。

Materials

Name of the Reagent/Equipment Company Catalogue Number Comments
ADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212352  
BACS-120 Sample Changer Bruker    
Bruker Avance NMR Bruker   500 MHz
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Fraction V
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-15R Benchtop
Centrifuge Tubes Corning 430291 50 ml sterile polypropylene
Cryogenic Vials Corning 430488 2.0 ml sterile polypropylene
Cycloheximide A.G. Scientific C-1189 Toxic
D(+) – Glucose ACROS 41095-0010  
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385  
Erlenmeyer Flask VWR 89095-266 Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap
Flash Freeze Flask VWR 82018-226 750 ml
Freeze Dryer VWR 82019-038 4.5 L Benchtop
Glycerol GibcoBRL 15514-029  
Incubator New Brunswick Innova 40 Benchtop shaker
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911-100  
Lysis Machine MP Biomedicals FastPrep-24  
Microcentrifuge Eppendorf 5415D Benchtop
Microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Benchtop
Middlebrook 7H9 Broth Difco 271310  
NMR tubes Norell ST500-7 5mM
OADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212351  
Oleic Acid Sigma O1008  
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH0266  
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH0268  
Rotor – Microfuge 22R Beckman Coulter F241.5P Sealed and polypropylene
Rotor – Allegra X-15R Beckman Coulter SX4750 With bio-certified covers
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3  
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 Cambridge Isotope DLM-48  
Spectrophotometer Beckman Coulter DU-530  
Spectrophotometer Cuvettes LifeLINE LS-2410 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides
Syringe Becton Dickinson 309585 Sterile, 3 ml Luer-Lok
Syringe Filter Nalgene 190-2520 0.2 μm sterile cellulose acetate
Tween 80 Fisher Scientific BP338-500  

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Cite This Article
Zinniel, D. K., Fenton, R. J., Halouska, S., Powers, R., Barletta, R. G. Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies. J. Vis. Exp. (67), e3673, doi:10.3791/3673 (2012).

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