Preparazione del campione di<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica
Summary
Il profilo metabolico di<em> Mycobacterium tuberculosis</em> È determinata dopo la crescita in colture in brodo. Le condizioni possono essere variate per testare gli effetti di integratori alimentari, ossidanti e anti-tubercolosi agenti sul profilo metabolico di questo microrganismo. Procedura per la preparazione estratto è applicabile sia per 1D<sup> 1</sup> H e 2D<sup> 1</sup> H-<sup> 13</sup> C NMR.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis è una delle principali cause di mortalità degli esseri umani su scala globale. L'emergere di due multi-(MDR) e estesamente-(XDR) ceppi farmaco-resistenti minaccia di far deragliare attuali sforzi di lotta contro la malattia. Pertanto, vi è una necessità urgente di sviluppare farmaci e vaccini che sono più efficaci di quelle attualmente disponibili. Il genoma di M. la tubercolosi è nota da più di 10 anni, ma ci sono importanti lacune nella nostra conoscenza della funzione genica e essenzialità. Molti studi hanno utilizzato da analisi di espressione genica sia a livello trascrittomica e proteomica per determinare gli effetti dei farmaci, ossidanti, e le condizioni di crescita sui modelli globali di espressione genica. In definitiva, la risposta finale di questi cambiamenti si riflette nella composizione metabolico del batterio comprendere alcune migliaia di sostanze a basso peso molecolare. Confrontando i profili metabolici di tipo selvatico e mutanti, sia trattata o treated con un particolare farmaco, può effettivamente permettere l'identificazione di destinazione e può portare allo sviluppo di nuovi inibitori con attività anti-tubercolare. Analogamente, gli effetti di due o più condizioni del metaboloma può anche essere valutato. Risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnologia potente che viene utilizzato per identificare e quantificare intermedi metabolici. In questo protocollo, le procedure per la preparazione di M. tubercolosi estratti cellulari per l'analisi NMR metabolomica sono descritti. Colture di cellule vengono coltivate in condizioni appropriate e richiesto livello di biosicurezza 3 di contenimento 1, raccolte e sottoposte a lisi meccanica pur mantenendo basse temperature per massimizzare la conservazione dei metaboliti. Lisati cellulari sono recuperati, filtrati sterilizzato, e conservati a temperature bassissime. Aliquote di questi estratti di cellule sono piastrate su agar Middlebrook 7H9 per unità formanti colonia per verificare l'assenza di cellule vitali. Su due mesi di incubazione a 37 ° C, se non vicolonie capaci si osservano, i campioni vengono rimossi dalla struttura di contenimento per il trattamento a valle. Sono estratti liofilizzati, risospese in tampone deuterato e iniettato nello strumento NMR, catturando dati spettroscopici che viene poi sottoposto ad analisi statistica. Le procedure descritte possono essere applicate sia unidimensionale (1D) 1 H NMR e bidimensionale (2D) 1 H-13 C NMR. Questa metodologia fornisce più affidabile di identificazione piccolo peso molecolare metabolita e analisi quantitative più affidabili e sensibili di composizioni estratto cellulare metaboliche rispetto ai metodi cromatografici. Variazioni della procedura descritta in seguito alla fase di lisi cellulare può anche essere adattato per parallela analisi proteomica.
Protocol
Discussion
Un numero significativo di studi ha analizzato i profili di trascrittomica e proteomica di M. tubercolosi sotto una varietà di in vitro e in vivo. 11-16 definitiva, cambiamenti nell'espressione genica e dell'attività enzimatica portare a variazioni nella concentrazione di piccole molecole di peso molecolare. La descrizione completa di questi composti costituisce il metaboloma. Pertanto, gli effetti delle droghe e delle condizioni di crescita variabile sulle vie metaboliche…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri dei laboratori del dottor Barletta e il Dott. Powers per gli utili commenti durante lo sviluppo del protocollo. Ringraziamo Wendy Austin per le discussioni utili e correzione di bozze del manoscritto. Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato finanziato da borse di studio pilota di semi per ogni investigatore di cui sopra presso la University of Nebraska-Lincoln Center Biologia Redox (genitore sovvenzione # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI). Inoltre, ringraziamo il Dr. Ofelia Chacon per fornire fondi da lei R21 sovvenzioni (1R21AI087561-01A1) per le forniture di ricerca e di sostegno stipendio parziale signor Halouska di standardizzare le tecniche NMR riportati nella presente pubblicazione.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| ADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212352 | |
| BACS-120 Sample Changer | Bruker | ||
| Bruker Avance NMR | Bruker | 500 MHz | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Fraction V |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | Benchtop |
| Centrifuge Tubes | Corning | 430291 | 50 ml sterile polypropylene |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | 2.0 ml sterile polypropylene |
| Cycloheximide | A.G. Scientific | C-1189 | Toxic |
| D(+) – Glucose | ACROS | 41095-0010 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385 | |
| Erlenmeyer Flask | VWR | 89095-266 | Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap |
| Flash Freeze Flask | VWR | 82018-226 | 750 ml |
| Freeze Dryer | VWR | 82019-038 | 4.5 L Benchtop |
| Glycerol | GibcoBRL | 15514-029 | |
| Incubator | New Brunswick | Innova 40 | Benchtop shaker |
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911-100 | |
| Lysis Machine | MP Biomedicals | FastPrep-24 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | Benchtop |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | Benchtop |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco | 271310 | |
| NMR tubes | Norell | ST500-7 | 5mM |
| OADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212351 | |
| Oleic Acid | Sigma | O1008 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | VWR | BDH0266 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR | BDH0268 | |
| Rotor – Microfuge 22R | Beckman Coulter | F241.5P | Sealed and polypropylene |
| Rotor – Allegra X-15R | Beckman Coulter | SX4750 | With bio-certified covers |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 | Cambridge Isotope | DLM-48 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU-530 | |
| Spectrophotometer Cuvettes | LifeLINE | LS-2410 | 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides |
| Syringe | Becton Dickinson | 309585 | Sterile, 3 ml Luer-Lok |
| Syringe Filter | Nalgene | 190-2520 | 0.2 μm sterile cellulose acetate |
| Tween 80 | Fisher Scientific | BP338-500 |
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