Summary

Gene Transfer per l'orecchio del mouse Sviluppo Inner<em> In Vivo</em> Elettroporazione

Published: June 30, 2012
doi:

Summary

L'orecchio interno è un topo placode derivato il cui organo sensoriale per lo sviluppo del programma è elaborato durante la gestazione. Definiamo uno<em> In utero</em> Tecnica di trasferimento genico composto da tre fasi: laparotomia ventrale del mouse, microiniezione transuterine e<em> In vivo</em> Elettroporazione. Usiamo la microscopia video digitale per dimostrare le critiche tecniche sperimentali embriologici.

Abstract

L'orecchio interno dei mammiferi ha 6 epiteli sensoriali distinti: 3 creste in ampolle dei canali semicircolari, macule nel utricolo e sacculo, e l'organo del Corti nella coclea a spirale. Le creste e macule contengono cellule ciliate vestibolari che trasducono stimoli meccanici per la pongono al servizio della speciale senso di equilibrio, mentre le cellule uditive dei capelli in dell'organo del Corti sono i trasduttori primari per l'audizione 1. Il destino specifica cella in questi epiteli sensoriali e morfogenesi dei canali semicircolari e la coclea hanno luogo durante la seconda settimana di gestazione nel topo e sono in gran parte completati prima della nascita 2,3. Studi sullo sviluppo dell'orecchio interno del mouse sono regolarmente condotti da raccolta embrioni transgenici in diverse fasi embrionali o post-natale al fine di conoscere le basi molecolari di cellulare e / o morfologica fenotipi 4,5. Ipotizziamo che il trasferimento del gene per l'orecchio interno del mouse in via di sviluppo in utero </ Em> nel contesto di guadagno-e la perdita di funzione studi rappresenta un approccio complementare alla transgenesi mouse tradizionale per l'interrogatorio dei meccanismi genetici alla base dei mammiferi lo sviluppo dell'orecchio interno 6.

Il paradigma sperimentale per condurre studi misexpression gene nel topo in via di sviluppo dell'orecchio interno dimostrato qui si risolve in tre fasi generali: 1) laparotomia ventrale; 2) microiniezione transuterine e 3) elettroporazione in vivo. Laparotomia ventrale è una tecnica di sopravvivenza del mouse che permette di esternalizzazione chirurgica dell'utero per accedere sperimentale per gli embrioni impiantati 7. Microiniezione Transuterine è l'uso di smussati, micropipette capillari di vetro per introdurre plasmide di espressione nel lume della vescicola otica o otocyst. In vivo elettroporazione è l'applicazione di onda quadra, diretti impulsi di corrente per guidare l'espressione plasmidico in 8-10 cellule progenitrici.

<p class = "jove_content"> Abbiamo precedentemente descritto questa elettroporazione-based tecnica di trasferimento genico e incluso delle note dettagliate su ogni fase del protocollo 11. Mouse tecniche sperimentali embriologici può essere difficile da imparare dalla prosa e immagini fisse da solo. Nel presente lavoro, dimostriamo i 3 passaggi della procedura di trasferimento genico. La maggior parte critica, abbiamo distribuire microscopia video digitale per mostrare con precisione come: 1) identificare l'orientamento dell'embrione in utero, 2) riorientare embrioni per il targeting iniezioni al otocyst; 3) microinject DNA miscelata con una soluzione tracciante colorante nella otocyst al giorno e 11,5 embrionali 12,5; 4) elettroporare il otocyst iniettato; e 5) embrioni etichette elettroporate per la selezione post-natale alla nascita. Forniamo esempi rappresentativi di successo trasfettate orecchio interno, di una guida pittorica per le cause più comuni di mistargeting otocyst, discutere su come evitare i più comuni errori metodologici e attuali orientamenti per la scrittura di un utero in gene trasferimento degli animali protocollo di cura.

Protocol

1. Laparotomia ventrale Anestetizzare una diga i cui embrioni sono al giorno embrionale 11,5 (E11.5, a mezzogiorno del giorno viene rilevata una spina vaginale è il giorno 0,5 dello sviluppo embrionale) mediante iniezione intraperitoneale di soluzione di sodio pentobarbital anestesia (7,5 pl per grammo di peso corporeo). Soluzione di lavoro anestetico: 180 pl di 50 mg / mL di sodio pentobarbital, 100 pl di etanolo assoluto, 320 pl di 65 mg / ml di solfato di magnesio acquoso (modula tono uterina), e 400 pl d…

Discussion

Trasferimento del gene per l'orecchio del mouse in via di sviluppo interno: L'orecchio interno del mouse si sviluppa dalla placode otic durante la prima settimana di sviluppo post-impianto 12,13. Di giorno embrionale 9.5 (E9.5), il placode ha invaginato e trasformato in una vescicola piena di liquido chiamato otocyst 2. Precursori Otic in vescicole dare origine alle cellule sensoriali e nonsensory all'interno dell'orecchio interno matura così come i neuroni che inn…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Humana Press per il permesso di pubblicare la pipetta figura microiniezione di fabbricazione, che è originariamente apparso a pagina 130 di riferimento 11; Larry Dlugas e Steven Wong, OHSU Ministero delle Comunicazioni educativi, per videografia, Larry Dlugas per il design e video editing; Adam M. O 'Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco per la progettazione di nostra consuetudine orizzontale, cappa a flusso laminare e Les Goldsmith per fornire lo schema tecnico; Victor Monterroso, MV, MS, PhD e Tom Chatkupt, DVM, OHSU Dipartimento di Medicina comparativa, per la guida con il nostro animali protocollo di cura, tecniche chirurgiche, e profilattico analgesia regime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, per condividere la sua dispensa sulle tecniche di sutura veterinaria, Edward Porsov, MS, per la progettazione la nostra workstation video di Adobe Premiere Pro microscopia computer; e Leah bianco e Jonas Hinckley dei LNS didascalie (Portland, OR). Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institute on Deafness e other disturbi della comunicazione: DC 008595 R01 e R01 DC 008595-04S2 (a JB) e P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Core Center Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Micro Sterilizing Case ROBOZ RS-9900a 8X8.5X1.25 inches
Ball-tipped scissors Fine Science Tools 14109-09  
Ring forceps Fine Science Tools 11106-09 4.8mm ID/6mm OD
Adson Tissue Forceps Fine Science Tools 11027-12  
Needle driver Fine Science Tools 12502-12  
Allergy Syringe Tray Becton Dickison 305536  
Suture 6-0 Syneture GL-889 0.7 metric gastrointestinal suture
Lactated Ringer’s Injection USP Baxter 2B2323  
Fast green Sigma Aldrich F7258  
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 30-0053  
Nembutal Sodium Solution OVATION Pharmaceuticals Inc. NDC 67386-501-52  
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500  
Propylene glycol Fisher Scientific P355-1  
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500  
Meloxicam Boehringer Ingeheim NADA 141-219  
Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV-10 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory
Micropipette holder Warner Instruments MP-S15T For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing.
Tweezers-style electrode Protech International Inc. CUY650P5 5 mm outer diameter
Square Wave Electroporator Protech International Inc. CUY21EDIT Footpedal recommended
PICOSPRITZER III Parker Hannifin 051-0500-900 Footpedal recommended
Manual Control Micromanipulator Harvard Apparatus 640056  
Horizontal laminar flow clean bench Envirco   Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic.
Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine Bartels and Stout and Lumencor MZ10F with Lumencor SOLA light engine Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended
Alexa Fluor 594 Dextran Invitrogen D22913 10mg/ml, aqueous
Alexa Fluor 488 Dextran Invitrogen D22910 10mg/ml, aqueous
Enviro-dri Shepherd Specialty Papers   www.ssponline.com

References

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Cite This Article
Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation. J. Vis. Exp. (64), e3653, doi:10.3791/3653 (2012).

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