Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door<em> In Vivo</em> Elektroporatie
Summary
De muis binnenoor is een placode-afgeleide zintuig waarvan het ontwikkelings-programma wordt uitgewerkt tijdens de dracht. We definiëren een<em> In de baarmoeder</em> Genoverdracht techniek die bestaat uit drie stappen: de muis ventrale laparotomie, transuterine micro-injectie, en<em> In vivo</em> Elektroporatie. We maken gebruik van digitale video-microscopie om de kritische experimentele embryologische technieken te demonstreren.
Abstract
De zoogdieren binnenoor heeft 6 verschillende sensorische epitheel: 3 cristae in de ampullen van de halfcirkelvormige kanalen, maculae in de utricle en sacculus, en het orgaan van Corti in de opgerolde slakkenhuis. De cristae en maculae bevatten vestibulaire haarcellen die transduceren mechanische stimuli om de speciale gevoel van evenwicht dienstig zijn, terwijl de auditieve haarcellen in het orgaan van Corti zijn de primaire transducers voor het horen van 1. Lot van de cel specificatie in deze sensorische epitheel en morfogenese van de halfcirkelvormige kanalen en het slakkenhuis vindt plaats tijdens de tweede week van de zwangerschap in de muis en zijn grotendeels voltooid voor de geboorte 2,3. Ontwikkelings-studies van de muis binnenoor worden routinematig uitgevoerd door het oogsten van transgene embryo's op verschillende embryonale of postnatale fase inzicht te krijgen in de moleculaire basis van cellulaire en / of morfologische fenotypes 4,5. Onze hypothese is dat genoverdracht naar de ontwikkelingslanden muis binnenoor in de baarmoeder </ Em> in het kader van de winst-en verlies-van-functie studies is een gratis benadering van de traditionele muis transgenese voor de ondervraging van de genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan zoogdieren binnenoor ontwikkeling 6.
De experimentele paradigma om gen-misexpression studies uit te voeren in de ontwikkelingslanden muis binnenoor aangetoond hier is opgelost in drie algemene stappen: 1) ventrale laparotomie, 2) transuterine micro-injectie, en 3) in vivo elektroporatie. Ventrale laparotomie is een muis te overleven chirurgische techniek die uitbesteding van de baarmoeder toelaat te krijgen experimentele toegang tot de geïmplanteerde embryo's 7. Transuterine micro-injectie is het gebruik van schuine, glazen capillaire micropipetten tot expressie plasmide in het lumen van het otic blaasje of otocyst te introduceren. In vivo elektroporatie is de toepassing van blokgolf, gelijkstroom pulsen om de expressie plasmide rijden progenitorcellen 8-10.
<p clkont = "jove_content"> We hebben eerder beschreef dit elektroporatie op basis van gen-overdracht techniek en gedetailleerde opmerkingen opgenomen op elke stap van het protocol 11. Muis experimentele embryologische technieken kan het moeilijk zijn om te leren van proza en foto's alleen. In dit werk, tonen we de 3 stappen in de genoverdracht procedure. De meeste kritisch, zetten we digitale video-microscopie om precies te laten zien hoe je: 1) het identificeren embryo oriëntatie in de baarmoeder; 2) embryo's te heroriënteren voor het richten van injecties langs de otocyst; 3) microinject DNA gemengd met kleurstof tracer oplossing in de otocyst op embryonale dag 11.5 en 12,5; 4) electroporate de ingespoten otocyst, en 5) label geëlektroporeerd embryo's voor postnatale selectie bij de geboorte. Wij bieden representatieve voorbeelden van succesvol getransfecteerd innerlijke oren, een geïllustreerde gids voor de meest voorkomende oorzaken van otocyst mistargeting, bespreken hoe de gemeenschappelijke methodologische fouten te vermijden, en de huidige richtlijnen voor het schrijven van een in de baarmoeder gENE overdracht verzorging van dieren protocol.Protocol
Discussion
Gene transfer naar de ontwikkeling van de muis binnenoor: De muis binnenoor ontwikkelt zich vanaf de otic placode tijdens de eerste week van postimplantatie ontwikkeling 12,13. Door embryonale dag 9.5 (E9.5), heeft de placode geïnvagineerde en veranderd in een met vloeistof gevulde blaasjes genoemd otocyst 2. Otic voorlopers in het blaasje aanleiding geven tot de zintuiglijke en nonsensory cellen in het volwassen binnenoor en de neuronen die mechanisch gevoelige haarcellen innerve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Humana Press om toestemming om de micro-injectie pipet fabricage cijfer dat oorspronkelijk verscheen op pagina 130 van referentie 11 te publiceren; Larry Dlugas en Steven Wong, OHSU Department of Educational Communications, voor videografie, Larry Dlugas voor video-ontwerp en-bewerking; Adam M. O 'Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco voor het ontwerpen van onze op maat horizontale laminaire stroming kap en Les Goldsmith voor het verstrekken van de technische schema, Victor Monterroso, MV, MS, PhD en Tom Chatkupt, DVM, OHSU Vakgroep Vergelijkende Geneeskunde, voor informatie met onze verzorging van dieren protocol, chirurgische technieken, en profylactische analgesie regime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, voor het delen van zijn hand-out inzake veterinaire hechten technieken; Edward Porsov, MS, voor het ontwerpen van onze Adobe Premiere Pro video-microscopie computerwerkplek, en Leah Wit en Jonas Hinckley van LNS Captioning (Portland, OR). Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute on Doofheid en Other Communicatie aandoeningen: DC R01 008595 en DC R01 008595-04S2 (naar JB) en P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center Core Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | ROBOZ | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | Becton Dickison | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals Inc. | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. . Principles of Veterinary Suturing. , .
- Oesterle, A. . P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , (2011).
