Valutare alterazioni metaboliche epatiche durante la colonizzazione progressiva di Germe senza mouse da 1 H spettroscopia NMR

Summary

Una procedura di progressiva colonizzazione è descritto per valutare ulteriormente il suo impatto sul metabolismo epatico ospitante. La colonizzazione è monitorato non invasivo, valutando l'escrezione urinaria di co-metaboliti microbici da NMR basati su profili metabolici, mentre il metabolismo epatico viene valutata ad alta risoluzione Angle Spinning Magic (MAS HR) profilazione NMR di intatto biopsia.

Abstract

E 'noto che i batteri intestinali contribuiscono significativamente alla omeostasi host, fornendo una serie di benefici come la protezione immunitaria e la sintesi della vitamina. Essi hanno inoltre fornire l'host con una notevole quantità di sostanze nutritive, facendo di questo ecosistema un organo metabolico essenziale. Nel contesto di una crescente evidenza del legame tra la flora intestinale e la sindrome metabolica, comprendere l'interazione metabolica tra l'host e la sua flora intestinale sta diventando una sfida importante della biologia moderna. ^1-4

Colonizzazione (noto anche come processo di normalizzazione), designa la creazione di micro-organismi in un antico animale privo di germi. Mentre è un processo naturale che si verificano al momento della nascita, è utilizzato anche in adulti privo di germi animali per controllare l'ecosistema intestinale floreali e ulteriormente determinare il suo impatto sul metabolismo host. Una procedura comune per controllare il processo di colonizzazione è quello di utilizzare il metodo gavage con un singlE o una miscela di microrganismi. Questo metodo comporta una colonizzazione molto veloce e presenta lo svantaggio di essere estremamente stressante ^5. E 'quindi utile per ridurre al minimo lo stress e per ottenere un processo di colonizzazione lento ad osservare gradualmente l'impatto di stabilimento sul metabolismo batterico ospite.

In questo manoscritto, si descrive una procedura per valutare la modifica del metabolismo epatico durante un processo di colonizzazione graduale utilizzando una tecnica non distruttiva profili metabolici. Noi proponiamo di monitorare la colonizzazione microbica intestinale, mediante la valutazione dell'attività microbica intestinale metabolica riflette l'escrezione urinaria di metaboliti microbici co-profilatura di ¹ H NMR basati metabolica. Questo consente un apprezzamento della stabilità dell'attività microbica intestinale al di là della sede stabile l'ecosistema microbico intestinale solitamente valutata attraverso il monitoraggio dei batteri fecali da DGGE (gel elettroforesi denaturante gradiente). ⁶ Ilcolonizzazione si svolge in un ambiente convenzionale aperta ed è iniziata da una cucciolata sporca sporca da animali convenzionali, che servirà come controlli. Roditori sono animali coprofagi, questo garantisce una colonizzazione omogenea come descritto in precedenza ^7.

Profiling metabolico epatico viene misurato direttamente da una biopsia del fegato intatto con ¹ H ad alta risoluzione Magic Angle Spinning spettroscopia NMR. Questo semi-quantitativa tecnica offre un modo rapido per valutare, senza danneggiare la struttura delle cellule, i metaboliti importanti come trigliceridi, glucosio e glicogeno al fine di ulteriormente valutare la complessa interazione tra il processo di colonizzazione e il metabolismo epatico ^7-10. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi tessuto bioptico ^11,12.

Protocol

1. Colonizzazione di germi senza animali e la raccolta dei campioni Rimuovere sterile animali da isolatori e la casa in una stanza di allevamento in gabbie tradizionali dotati di filtro davanti alla animali convenzionali, che servirà come controlli (Figura 1). Mescolare mezzo della cucciolata (3 giorni) preso dalla gabbia di controllo convenzionale con la lettiera del germe senza animali. Tenere sempre 1 / 3 della lettiera sporca convenzionale ogni volta che è necessario rinnovarlo al fine di mant…

Discussion

In questo protocollo, abbiamo descritto una procedura di progressiva colonizzazione in un ambiente aperto di approfondire l'impatto della flora intestinale sul metabolismo epatico valutate di ¹ profiling H NMR HR MAS di intatto biopsia. Vari metodi di colonizzazione sono state descritte in letteratura. I metodi più comuni per colonizzare gli animali con un microbiota definiti sono sonda gastrica o l'acqua potabile contaminata ^19,20. Inoculazione fecale può essere utilizzato anche come des…

Materials

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker
1H HR MAS NMR solid probe	Bruker
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913