Summary

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Published: April 12, 2012
doi:

Summary

Cultured Muskelzellen sind ein unzureichendes Modell zu rekapitulieren innervierten Muskel<em> In-vivo-</em>. Eine funktionale Motoreinheit reproduziert werden kann<em> In-vitro-</em> Durch Innervation der differenzierten humanen primären Muskelzellen mit Rattenembryo Rückenmark Explantate. Dieser Artikel beschreibt die Co-Kulturen von Rückenmark und Muskelzellen Explantate etabliert werden.

Abstract

Humane primäre Muskelzellen aneurally in Monoschicht kultiviert sich selten spontan, weil, in Abwesenheit eines Nerven-Komponente, Zelldifferenzierung begrenzt ist und Motorneuronen Stimulation fehlt 1. Diese Einschränkungen erschweren die in vitro-Studie von vielen neuromuskulären Erkrankungen in kultivierten Muskelzellen. Wichtig ist, dass die experimentellen Randbedingungen von einschichtigen, kultivierten Muskelzellen durch funktionelle Innervation der Muskelfasern mit Rückenmark Explantate in Co-Kulturen überwunden werden.

Hier zeigen wir die verschiedenen Schritte, um eine effiziente, ordnungsgemäße Innervation von humanen primären Muskelzellen erzielen, was zu Differenzierung und Kontraktion Faser nach dem Verfahren von Askanas 2 entwickelt abzuschließen. Dazu werden Muskelzellen mit Rückenmark Explantate von Rattenembryonen bei ED 13,5 co-kultiviert, mit der Spinalganglien noch an das Rückenmark Scheiben befestigt. Nach ein paar Tagen, fi der MuskelMitglieder starten zu kontrahieren und schließlich zu quergestreiften durch Innervation durch funktionelle Neuriten Projektion aus dem Rückenmark Explantate, dass zu den Muskelzellen verbinden. Diese Struktur kann für viele Monate aufrechterhalten werden, einfach durch einen regelmäßigen Austausch des Kulturmediums.

Die Anwendungen dieser sehr wertvolles Werkzeug sind zahlreich, wie es ein funktionierendes Modell für multidisziplinäre Analysen der menschlichen Entwicklung der Muskulatur und Innervation darstellt. In der Tat tritt eine komplette De-novo-neuromuskulären Synapse Installation in einer Kulturschale, so dass eine einfache Messung vieler Parameter bei jedem Schritt in einer grundlegenden und physiologischen Kontext.

Nur um ein paar Beispiele, genomische und / oder Proteom-Studien zitieren kann direkt auf die Co-Kulturen durchgeführt werden. Darüber hinaus können Vor-und postsynaptischen Effekte gezielt und separat an der neuromuskulären Synapse beurteilt werden, da beide Komponenten aus verschiedenen Spezies stammen,Ratte und Mensch, beziehungsweise. Der Nerv-Muskel-Co-Kultur kann auch mit menschlichen Muskelzellen von Patienten mit Muskel-oder neuromuskuläre Erkrankungen 3 isoliert durchgeführt werden, und kann somit als Screening-Instrument für Wirkstoffkandidaten eingesetzt werden. Schließlich wird keine spezielle Ausrüstung, sondern eine regelmäßige BSL2 erforderliche Hilfe zu einer funktionellen Einheit Motor in der Kulturschale zu reproduzieren. Diese Methode ist somit sowohl für den Muskelaufbau sowie die neuromuskuläre Forschungsgemeinschaften für physiologische und mechanistische Studien der neuromuskulären Funktion wertvoll, in einem normalen Rahmen und Krankheit.

Protocol

1. Vorbereitung des Primary Human Muscle Cell Culture Stellen Sie die menschliche Muskelkraft Zellkulturen gemäß der Explantation-Re-Explantation Technik 4. Entfernen Sie zunächst nicht Muskelgewebe aus den Biopsien. Dann betten 1 mm 3 Muskel Explantate in einem Koagulum von Plasma, das Fibroblasten aus den Explantaten entstehen können. Die eingebetteten Explantate werden auf einem Plasma-Gelatine beschichtete Schale überführt und lassen Sie sie in normalen Nährmedium wa…

Discussion

Eine physiologische In-vitro-Werkzeug, um Muskel-Zell-Funktion in normalen und pathologischen Kontext zu studieren, ist von höchstem Interesse für die myologists, weil Muskel-Zellkulturen in der Regel nicht rekapitulieren die Bedeutung der mehrere Zellen und Zell-Typ-Verbindungen. Die Zugabe von gereinigtem motorischen Neuronen zu Muskelzellen ist nicht genug, um eine funktionelle Einheit Motors zu erreichen, da die Anwesenheit von Schwann-Zellen für die Innervation effizient zu sein 5 erforderlic…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Unsere Arbeit wird durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF), die Schweizer Initiative in Systembiologie (SystemsX.ch), der Gesellschaft für Muskelkranke USA (MDA), die Association Française contre les Myopathien (AFM), das Vereinigte Mitochondriopathie Stiftung unterstützt (UMDF), die Gebert-Rüf-Stiftung Seltene Erkrankungen Programm (GRF), der Schweizerischen Gesellschaft für Forschung der Muskelerkrankungen (SSEM / FSRMM), die Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und medizinische Forschung", der Roche Research Foundation und der Universität Basel.

Materials

Name of reagent Company Catalog Number
HBSS Gibco/Invitrogen 14170
MEM Gibco/Invitrogen 31095
Medium 199 Gibco/Invitrogen 31153
Fetal Bovine Serum Fetal Clone Perbio SH30066.03
Insuline Sigma I9278
Human EGF Sigma E9644
Human FGF Sigma F0291
Penicillin/streptomycin solution Gibco 15140

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Cite This Article
Arnold, A., Christe, M., Handschin, C. A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells. J. Vis. Exp. (62), e3616, doi:10.3791/3616 (2012).

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