Bu protokol, büyük unilamellar lipid veziküller içine peptid translokasyonu kantitatif ölçmek için bir yöntem. Bu yöntem ayrıca membran translokasyon oranı hakkında bilgi sağlar ve çift katlı lipit katmanını etkin ve kendiliğinden geçtiğini peptidler tanımlamak için kullanılabilir.
Hücre zarları, hücre membran reseptörleri 1 yardımı olmadan kolayca çapraz peptidler aktif bir ilgi vardır . Bunların çoğu, sık sık ilaç taşıyıcı vektörler 1-3 olarak potansiyeli ile dikkat çeken hücre delici peptidler, olarak adlandırılır. Ayrıca, özellikle 4,5 membran litik olmayan mekanizmaları, hücre parçalama neden olmadan bakteri membranlar arası ve hücre içi süreçleri ile 6,7 müdahale ederek hücrelerini öldürmek ile faaliyet antimikrobiyal peptidler artan bir ilgi var . Nitekim, yazarlar, giderek hücre delici ve antimikrobiyal peptidler 1,8 arasındaki ilişkiyi işaret var . Membranı translokasyonu ve peptid yapısı ve yerini değiştirmek yeteneği arasında ilişki sürecinde bir firma anlayışı translokasyon için etkili, tekrarlanabilir testleri gerektirir. Bazı gruplar büyük unilamel içine translokasyon ölçmek için yöntemler önerdilar lipid veziküller (luvs) 9-13. Luvs bakteriyel ve ökaryotik hücre zarları için faydalı model olarak hizmet veren ve peptid floresan çalışmaları 14,15 sık sık kullanılır . Burada, ilk magainin ve buforin II 16,17 gibi antimikrobiyal peptidler, dikkate Matsuzaki ve arkadaşları tarafından geliştirilen yöntemin bizim uygulama açıklar. Bu yöntem için protokol sağlamaya ek olarak, biz de bu testte kullanarak translokasyon yeteneği rakamlarla veri analizi için basit bir yaklaşım sunuyoruz. Bu translokasyon testin diğerlerine göre avantajları membranı translokasyonu oranı hakkında bilgi vermek ve triptofan içeren peptidler, peptid özellikleri 18 değiştirebilir Ayrıca, floresan bir etiket gerektirmez bir potansiyele sahip olduğunu. Kısaca, lipid veziküller içine translokasyon yeteneği yerli triptofan artıkları ve d arasında Foster Rezonans Enerji Transferi (FRET) bir fonksiyonu olarak ölçülüransyl phosphatidylethanolamine proteinler ile ilişkili dış membran (Şekil 1) LUV. Hücre-delici peptidler luvs kapsüllenir sınır tanımayan tripsin karşılaşırsanız LUV membran ve sinyal FRET bir düşüş disassociation yol açan, bölünmüş. Translocating peptid için bu düşüş gözlenen sinyal luvs tripsin ve tripsin inhibitörü ya da lipid membranlar kendiliğinden çapraz peptid içeren tripsin luvs için maruz kaldığı hem de içeren aynı peptid gözlenen daha anlamlı olarak daha fazla FRET. Floresans bu değişiklik zamanla peptid translokasyonu doğrudan kantifikasyon sağlar.
Burada sunulan protokol lipid veziküllerin içinde ve dışında peptidler konsantrasyon göreceli değişimi değerlendirmek için kullanılabilir. Bu değişiklikler translokasyon yeteneği ile ilgilidir. Bu protokol, ilaç taşıyıcı vektörler olarak potansiyeli olan hücre delici peptidler tanımlamak için kullanılabilir. Hücre delici peptidler ilgi büyüdükçe, nicel bir şekilde, doğrudan translokasyon olayı ölçme yöntemleri geliştirilmiş ve nasıl kullanıldığını görmek için ilginç olacak. …
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, yararlı tartışmalar için Eleanor Fleming ve Jessica Chen teşekkür etmek istiyorum. Finansman Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIH-NIAID) Ödülü R15AI079685 ve Araştırma Kurumu Cottrell Koleji Bilim Ödülü verildi. Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve Staley fon Ek öğrenci destek sağlanmıştır.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
HEPES | Sigma | H-3375 |
NaCl | Sigma | S-9625 |
EDTA | Sigma | E5134 |
NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |